摘 要：目的 探讨肺炎支原体(MP)在体外感染A549细胞后，诱导NLRP3炎症小体引起的免疫炎症反应与NLRP3炎症小体对A549细胞凋亡的调控作用，以及清肺通络方(QTF)对NLRP3炎症小体的调节及其对下游相关细胞因子IL-18、IL-1β的干预作用。方法 将QTF采用醇提法提取后，加入MP感染的A549细胞中，使用CCK-8实验检测不同浓度(0.1,0.5,1,2,4 mg/L)和不同时间点(24,48,72 h)的QTF,并制备抑制/过表达NLRP3质粒，根据CCK-8实验所测得的最佳药物浓度，将实验进行分组，检测NLRP3炎症小体各组成蛋白ASC、Caspase-1、NLRP3表达，细胞因子IL-18、IL-1β的表达水平以及A549细胞凋亡率。结果 MP感染A549细胞后，使得A549细胞NLRP3炎症小体各组成蛋白ASC、Caspase-1、NLRP3表达量上升，下游相关炎症细胞因子IL-18、IL-1β表达水平升高明显，说明NLRP3炎症小体可以被MP激活，并且产生一系列的炎症反应，且流式细胞术检测发现MP感染A549细胞后，细胞凋亡率上升。经清肺通络方干预后，NLRP3炎症小体各组成蛋白ASC、Caspase-1、NLRP3表达量下降，下游相关炎症细胞因子IL-18、IL-1β表达水平显著降低，说明清肺通络方可以抑制被激活的NLRP3炎症小体，从而使下游炎症细胞因子IL-18、IL-1β下调，且流式细胞术检测发现使用清肺通络方后，细胞凋亡率下降。结论 MP感染A549细胞后，可以激活处于抑制状态的NLRP3炎症小体，并且产生一系列的免疫炎症反应，增加下游炎症因子的释放，增加细胞凋亡率。清肺通络方可以下调NLRP3炎症小体，减轻炎症反应，抑制细胞凋亡，并且清肺通络方对NLRP3炎症小体的调控作用有浓度依赖性，浓度越大，保护作用越明显。
关键词：肺炎支原体 清肺通络方 NLRP3炎症小体 细胞实验
Study on Therapeutic Mechanism of Qingfei Tongluo Formula（清肺通络方）by Regulating NLRP3 Inflammatory on Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia
ZHAO Xiaoyang JIANG Yonghong XIAO Zhen LYU Jiajia SONG Yao
Department of Pediatric, Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine;
Abstract：Objective To investigate the immune inflammatory response induced by NLRP3 inflammasome after mycoplasma pneumoniae(MP) infected A549 cells in vitro, the regulatory effect of NLRP3 inflammasome on A549 cell apoptosis, the regulation of Qingfei Tongluo Formula(清肺通络方,QTF) on NLRP3 inflammasome and the intervention effect of its downstream related cell factors IL-18 and IL-1β. Methods QTF was extracted by ethanol extraction and added to MP-infected A549 cells. The optimal concentration of the drug was calculated by CCK-8 test to detect the QTF of different concentrations(0.1,0.5,1,2,4 mg/L) and different time points(24,48,72 h). Inhibition/over-expression of the NLRP3 plasmid was prepared and the experiments were grouped according to the optimal drug concentration measured by the CCK-8 assay. The expressions of ASC,Caspase-1 and NLRP3 in NLRP3 inflammatory vesicles, IL-18 and IL-1β were detected. The apoptosis rate was detected by flow cytometry. Results After MP infected A549 cells, the expressions of NLRP3 inflammatory body proteins ASC,Caspase-1 and NLRP3 were increased, and the downstream related inflammatory cytokines IL-18 and IL-1β increased, indicating that NLRP3 inflammatory bodies can be activated by MP and produce a series of inflammatory reactions. Flow cytometry showed that the apoptosis rate was increased after MP infected A549 cells. After the intervention of QTF,the expressions of NLRP3 inflammatory body proteins ASC,caspase-1 and NLRP3 were decreased, and the downstream related inflammatory cytokines IL-18 and IL-1β decreased significantly, indicating that QTF can inhibit the activated NLRP3 inflammatory body, so as to reduce the downstream inflammatory cytokines IL-18 and IL-1β. Flow cytometry showed that the apoptosis rate was decreased after using QTF. Conclusion The infection with MP activates NLRP3 inflammatory vesicle pathway. QTF alleviates MPP inflammation most likely by inhibiting the activation pathway of NLRP3 inflammatory bodies pathway. QTF alleviates MPP inflammation most likely by inhibiting the activation pathway of NLRP3 inflammatory bodies.
Keyword：mycoplasma pneumoniae; Qingfei Tongluo Formula(清肺通络方); NLRP3 Inflammatory; cell experiment;
肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae, MP)是一种介于细菌和病毒之间的无细胞壁的微生物，为儿童常见呼吸道感染病原体之一。MP感染所引起的支原体肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia, MPP)约占社区获得性肺炎的20%～40%,且呈不断上升趋势[1-2]。
免疫功能紊乱在MPP发病过程中发挥重要作用，近年研究发现固有免疫识别受体中的NLRP3[LRR and pyrin-domain(PYD)-containing protein 3]炎症小体与肺部感染疾病关系密切[3-4]。当MP等病原微生物侵入机体后，可使处于抑制状态中的NLRP3炎症小体被激活，从而进一步活化其各组成蛋白NLRP3、ASC和Caspase-1[5]。此外MP感染还可导致促炎细胞因子，肿瘤坏死因-α(TNF-α)和趋化因子，如白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18),从而导致肺损伤[8]。
本实验拟以NLRP3炎症小体相关基因/蛋白表达为切入点，观察清肺通络方调控MP感染肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)NLRP3炎症小体及其下游相关炎症因子IL-1β、IL-18,进而验证清肺通络方对肺炎支原体的作用机制，为中药防治MP提供新思路。
1 实验材料
1.1 药物与主要试剂
中药清肺通络方(醇提法):桑白皮9 g, 地骨皮9 g, 桃仁9 g, 矮地茶9 g, 紫苏子9 g, 葶苈子9 g, 苦杏仁9 g, 甘草3 g。中药购自于华宇中药上海有限责任公司，由上海中医药大学附属龙华医院购置。CCK-8(SAB,CP002);Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司，C1062);RPMI-1640(Hyclone, SH30809.01B);BCA蛋白定量试剂盒(thermo, PICPI23223);ASC抗体(Abcam, ab128097);Caspase-1抗体(Abcam, ab1872);NLRP3抗体(Abcam, Ab214185);羊抗兔HRP标记二抗(碧云天，A0208);羊抗鼠HRP标记二抗(碧云天，A0216);驴抗山羊HRP标记二抗(碧云天，A0181);SYBR Green PCR试剂盒(Thermo, #K0223);逆转录试剂盒(Fermentas, #K1622);肺炎支原体核酸检测试剂盒(PCR 荧光探针法，Cat, #DA-D064,达安基因);Trizol(invitrogen, 1596-026);人白细胞介素-18(IL-18)ELISA试剂盒(X-Y Biotechnology, XY-E10092);人白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒(X-Y Biotechnology, GS-E10083)。
1.2 肺炎支原体菌株
肺炎支原体国际标准菌株MPFH,美国ATCC,产品号：ATCC15531。
1.3 A549细胞
人肺腺细胞(A549细胞)来源于龙华医院肿瘤研究所。
2 实验方法
2.1 药物提取和制备
用醇提取法精确称取清肺通络方，将所有药材研磨粉碎后，放入容器，用10倍纯水浸泡40 min, 经2次煎煮过滤后(第1次1 h, 第2次30 min),浓缩药液至浸膏状，在70 ℃烘箱中干燥以制备使用的粉末。
2.2 肺炎支原体菌株扩增
每100 mL支原体肉汤培养基，需支原体肉汤干粉2.04 g, 葡萄糖0.5 g, 双蒸水80 mL、0.1%酚红2 mL混匀后121 ℃高压灭菌15 min, 取支原体添加剂-G·SR0059溶于20 mL高压灭菌处理的蒸馏水中，并在冷却至50 ℃时加入。将暗红色菌液于4 ℃保存。使用液体培养法连续将菌种传代，选择第3代，选取颜色变化单位(color·change·units, CCU)测定菌液浓度，进行后续实验时，将原始MP菌液稀释至1×107 CCU/mL。
2.3 A549细胞模型制备与基于抑制/过表达NLRP3基因分组
人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549细胞替代，Atcc, 15531),常规复苏后，按计数量用含10%胎牛血清的F12K培养基调整细胞浓度至1×109/L,按每孔0.5 mL接种至96孔培养板，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长进入对数增殖期时，收获培养细胞。细胞传代培养至对数生长期时，用1×107 ccu/mL浓度MP菌液进行感染，并设立阴性对照组，于37 ℃,5% CO2条件下分别继续培养24 h。根据NCBI网站中搜索获得NLRP3(人)基因序列，合成靶向NLRP3的siRNA表达载体及过表达质粒载体。通过Ambion公司在线软件Block-IT RNAi Designer设计NLRP3-siRNA;并根据目的基因的DNA序列，直接设计合成过表达质粒载体(由上海嘉因生物有限公司构建)。将A549细胞随机分为7组：空白对照组(Control组)、MP诱导A549细胞组(Model组)、MP诱导+空载组(MP+vector组)、NLRP3 siRNA预处理+MP诱导组(MP+siRNA组)、MP诱导+清肺通络方组(MP+QTF组)、MP诱导+清肺通络方+空载组(MP+QTF+vector组)、MP诱导+清肺通络方+基因过表达组(MP+QTF+over-expression组)。清肺通络方用药浓度使用CCK-8实验检测后，最佳浓度为4 mg/L。详见图 1。
2.4 CCK-8法检测不同浓度清肺通络方水提物对MP感染A549细胞活力的影响
A549细胞用含10%胎牛血清，1%双抗(青链霉素混合液)的RPMI-1640培养液，置于37 ℃,5% CO2的培养箱中进行培养。将处于对数生长期的细胞，在显微镜下计数后制成5×104个细胞/mL的细胞悬液。分别取100 μL至96孔培养板，每种细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，5×103个细胞/孔，以100 μL培养液做空白对照，37 ℃培养过夜。分别在各个实验组转染后0、24、48、72 h后，按1∶10体积比混合CCK-8和无血清必需基本培养基，每孔100 μL 加入待测孔中，在37 ℃,5% CO2培养箱中孵育1 h, 用酶标仪测定450 nm波长吸光度，记录每块板的数值。
2.5 PCR体外扩增法定量检测A549细胞NLRP3炎性体相关蛋白mRNA
用Trizol提取细胞总RNA,使用SYBR Green PCR试剂盒进行检测。Real-time PCR扩增总反应程序为95 ℃,10 min(95 ℃,15 s; 60 ℃,45 s)×40;95 ℃,15 s; 60 ℃,1 min; 95 ℃,15 s; 60 ℃,15 s。数据采用仪器自带软件ABI Prism 7300 SDS Software分析。对于ASC蛋白PCR扩增引物是：5′ CTGACGGATGAGCAGTACC 3′(正向)和5′ AGGACTGGGACTCCCTTAG 3′(反向)。对于Caspase-1蛋白PCR扩增引物是：5′ ATTTGAGCAGCCAGATGGTAG 3′(正向)和5′ TGCCCACAGACATTCATACAG 3′(反向)。对于NLRP3蛋白PCR扩增引物是：5′ CCTGGAGGATGTGGACTTG 3′(正向)和5′ GGTCTGCCTTCTCTGTCTG 3′(反向)。获得目的基因和内参基因的Ct值，计算2-△△CT作为目的基因的相对表达水平。
2.6 Western blot法检测A549细胞NLRP3炎性体相关蛋白表达
将需要抽提蛋白的细胞，PBS洗涤两次，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液，4 ℃充分裂解细胞，95 ℃以上加热10 min, 12000 g离心 10 min, 取上清，使用BCA 法测定蛋白浓度。该将上清液(约为25 μg蛋白)与适量样品缓冲液(Loading Buffer)混合后，使用与动物实验相同步骤，半干式转法将蛋白转移至PVDF膜上(25 V,30 min),封闭后加一抗ASC(1∶500)、Caspase-1(1∶1000)、NLRP3(1/1000)、GAPDH(1∶1000)工作液4 ℃孵育过夜，加入二抗封闭洗涤后，使用ECL化学发光检测进行显色。
2.7 ELISA法检测A549细胞上清液IL-1β、IL-18水平
取A549细胞上清液，准备好试剂和标准品，严格按照ELISA试剂盒说明书分别检测A549细胞上清液IL-1β、IL-18水平，450 nm波长处测定样本OD值，绘制标准曲线并查找对应的浓度范围。
2.8 A549细胞凋亡检测实验
A549细胞用含10%胎牛血清，1%双抗(青链霉素混合液)的RPMI-1640培养液，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养。对数生长期的细胞用胰酶消化后以50万细胞/孔的密度接入6孔板中，细胞融合度达到50%时，进行转染和药物处理48 h后，把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞1次，用胰蛋白酶(可含EDTA)将细胞消化下来。再加入细胞培养液后，1000 g离心5 min, 弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5～10万重悬的细胞，1000 g离心5 min, 弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC,轻轻混匀，4 ℃避光孵育15 min, 最后加入5 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，4 ℃避光孵育5 min。同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
3 统计学分析
数据统计分析采用SPSS 21.0统计软件，以One-Way Anova的Homogeneity-of-variance进行方差齐性检验，如方差齐则直接进行单因素方差分析，并用LSD程序进行两两比较；如方差不齐则用Transform中Rank Cases进行变量变换后，再用One-Way Anova进行单因素方差分析，并用LSD程序进行两两比较，相关性分析采用等级相关检验。P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 不同浓度清肺通络方醇提物对MP感染A549细胞活力的影响
结果显示，由SPSS统计(经方差齐性检验，方差齐者，两两比较采用LSD方法分析；如方差不齐，则用Transform中Rank Cases进行变量变换后，再用One-Way Anova进行单因素方差分析，并用LSD程序进行两两比较，相关性分析采用等级相关检验)得出，清肺通络方醇提物IC50=53.84%,对应为48 h A549细胞存活率；其中与Control组相比，Model组细胞存活率下降(P<0.001);与A549+MP组相比，各不同药物浓度组A549细胞存活率均上升(P<0.001),当清肺通络方水提物浓度在4 mg/L时，细胞存活率最大。说明低剂量的清肺通络方水提物对感染MP的A549细胞保护性弱，而药物浓度提高则对细胞的保护作用增强，且成浓度依赖性。
详见表1、图1。
表1 清肺通络方对MP感染A549细胞活力的影响(x¯±s)
图1 清肺通络方对MP感染A549细胞活力的影响
4.2 A549细胞mRNA结果表达
结果显示：Control组A549细胞ASC、Caspase-1、NLRP3蛋白 mRNA含量较少；与Control组相比，Model组、MP+vector组ASC、Caspase-1、NLRP3蛋白 mRNA含量明显增多(P<0.01);与Model组相比，MP+siRNA组ASC、Caspase-1蛋白mRNA含量显著降低(P<0.01),NLRP3蛋白 mRNA含量降低(P<0.05);与Model组相比，MP+QTF组ASC、Caspase-1蛋白mRNA含量下降(P<0.01),NLRP3蛋白 mRNA含量下降(P<0.05);与Model组相比，MP+QTF+vector组ASC、Caspase-1蛋白mRNA含量降低(P<0.01),NLRP3蛋白 mRNA含量降低(P<0.05);与Model组相比，MP+QTF+over-expression组ASC、Caspase-1蛋白mRNA含量降低(P<0.05),NLRP3蛋白 mRNA P﹥0.05无统计学意义，但与Control组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2和图2。
表2 各组细胞ASC、Caspase-1、NLRP3蛋白mRNA检测结果(x¯±s)
图2 各组细胞ASC、Caspase-1、NLRP3蛋白mRNA检测结果
表3 各组细胞ASC、Casepase-1、NLRP3蛋白检测结果(x¯±s)
4.3 WB法检测A549细胞NLRP3炎症小体蛋白表达
4.3.1 MP感染A549细胞后ASC、Caspase-1、NLRP3蛋白表达
详见表3、图3～图4。Model组与Control组相比，ASC蛋白表达明显升高(P<0.05),Caspase-1、NLRP3蛋白表达显著增高(P<0.001)。
4.3.2 抑制/过表达NLRP3炎症小体及清肺通络方干预后对MP感染A549细胞相关蛋白表达
与Control组相比，Model组、MP+vector组NLRP3炎症小体蛋白表达量增多(P<0.001)。与Model组相比，MP+siRNA组NLRP3炎症小体蛋白表达量明显降低(P<0.001),MP+QTF组与MP+QTF+vector组NLRP3炎症小体蛋白表达量降低(P<0.05),与MP+QTF+over-expression组比较差异无统计学意义(P>0.05),但与MP+QTF+vector组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4、图5～图6。
图3 各组细胞ASC、Caspase-1、NLRP3蛋白表达
图4 各组细胞ASC、Casepase-1、NLRP3蛋白检测结果
图5 各组细胞NLRP3炎症小体蛋白表达
表4 各组细胞NLRP3炎症小体蛋白检测结果(x¯±s)
4.4 A549细胞上清液IL-1β、IL-18水平
与Control组相比，Model组、MP+vector组IL-1β、IL-18含量明显升高(P<0.001);与Model组相比，MP+siRNA组、MP+QTF组、MP+QTF+vector组、MP+QTF+over-expression组的IL-1β、IL-18含量明显降低(P<0.001),详见表5,图7。
图6 各组细胞NLRP3炎症小体蛋白检测结果
4.5 流式细胞术检测A549细胞凋亡率
结果显示：与Control组对比，Model组作用于A549细胞48 h, 细胞凋亡大量增加，凋亡率为36.1%(P<0.01),坏死细胞率为2.2%,存活细胞较Control组减少；与Model组相比，MP+QTF组，细胞凋亡减少，凋亡率为18.1%(P<0.05),坏死细胞率为3.9%,存活细胞较Model组增多；在加入NLRP3 siRNA质粒干扰后，MP+siRNA组与MP+vector组相比，细胞凋亡下降明显，凋亡率为7.7%(P<0.01),坏死细胞率为1.9%,存活细胞明显多于MP+vector组；在加入NLRP3 过表达质粒干扰后，MP+QTF+over-expression组与MP+QTF+vector组相比，细胞凋亡增多，凋亡率为20.8%(P<0.05),坏死细胞率为7.6%,存活细胞少于MP+QTF+vector组，详见图 8。
表5 各组细胞上清液ELISA检测结果比较
图7 各组细胞上清液ELISA检测结果比较
5 讨论
中医学认为肺炎支原体具有较强的传染性、流行性，属温热火毒疫疠之邪，发病迅猛，自鼻窍气道而入，直侵肺络，易致肺络壅滞，肺失宣降而发病[6]。其次由于小儿肺、脾常不足，感染肺炎支原体后又导致肺气耗损，脾失健运，络气郁滞，导致后期肺脾气虚，邪毒侵袭，痰热内伏，气血痰瘀交织，病情迁延反复，形成虚实夹杂之证。清肺通络方(桑白皮、地骨皮、桃仁、矮地茶、杏仁、紫苏子、葶苈子、甘草)是在儿科经典名方泻白散(桑白皮、地骨皮、甘草)基础上与苏葶丸加减而成，以“肺络”理论为指导，结合临床实践，用于治疗儿童MMP。该方秉承以清肺法为基础，化痰祛瘀通络法并举的理念，从恢复肺络气血供给及运行来改善支原体外邪所致的肺络痹阻，维持正常肺之通气与宣降功能。桑白皮泻肺平喘，利水消肿；地骨皮凉血除蒸，清肺降火，共为君药。桃仁活血润肠；矮地茶化痰止咳，活血利湿；两药合用，具活血化瘀通络之效，又可助君药降气平喘，故共为臣药。杏仁苦温宣肺；苏子降气消痰；葶苈子泻肺平喘，利水消肿，共为佐药。甘草祛痰止咳，调和诸药，而为使药。全方相合，清肺化痰并用，使被毒热郁闭的肺之气络得通，活血通络并举；使瘀滞的肺之血络得活，肺宣肃如常则咳喘自平。
图8 各组流式细胞术检测A549细胞凋亡率
现代医学研究发现，炎症因子以及免疫功能紊乱[7]在MPP发病过程中发挥重要作用，而NLRP3炎症体是目前已经明确的炎症反应关键的调控点，且与肺部感染疾病关系密切[8-10]。经典的炎症小体由三部分组成：1)核普酸结合寡聚化结构域(NLR)或者黑色素瘤缺乏因-2样受体(ALR),作为框架蛋白或应激信号感受器；2)凋亡相关斑点样蛋白(ASC),作为接头蛋白；3)半胱天冬蛋白酶-1(Caspase-1)[11]。NLRP3炎症小体即由NLRP3、ASC及Caspase-1组成，通常情况下NLRP3处于自身抑制状态。其在细菌、病毒以及真菌等病原体引起的炎症反应中被激活，继而激活Caspase-1,裂解pro-IL-1β、pro-IL-18成为下游成熟炎症细胞IL-1β、IL-18,继而作为促炎因子诱导大量炎性细胞因子及趋化因子释放，介导一系列炎症反应，在MPP的发生和发展过程中起重要作用。Caspase-1在炎症反应中起着核心调控作用[12-13]。免疫炎症最终均有细胞凋亡的存在，细胞凋亡整体过程通过Caspase家族级联反应实现，由凋亡起始Caspase-8、Caspase-9等最终激活Caspase-3。Caspase-3表达的增加或减少可作为免疫炎症反应及细胞凋亡的指标[14]。CHEN M等[15]研究证实MP感染后存在炎症细胞因子网络失调，IL-4,IL-6,IL-1β、IL-18等均有上升，且IL-1β、IL-18的分泌与NLRP3炎症小体的激活有密切关系，以上研究都表明NLRP3炎症小体通路的激活与MPP的发生、发展有一定关系。
本研究中结果显示MP感染A549细胞后，NLRP3炎性小体各组成蛋白表达量均上升，提示MP首先激活TLR4[16](toll like receptor 4),然后通过 NF-κB信号通路转录和翻译NLRP3炎症小体各个蛋白，转录后通过组合NLRP3多蛋白复合体活化NLRP3炎症小体。此时位于NLRP3炎症小体接头位置的NLRP3蛋白C端的亮氨酸重复序列(leucine-rich-repeat domain, LRR)识别此危险信号，通过中段特征性的核苷酸寡聚化结构域(nucleoside triphosphatase domain, NACTH) 介导NLR寡聚化并形成炎性小体的核心结构[17],并将信号传导至ASC蛋白的PYD结构。ASC蛋白在NLRP3炎性小体活化过程中起重要作用，通过自身同型的PYD与NLR的PYD相互作用，并通过CARD结构域招募无活性的pro-Caspase-1,从而介导NLRP3激活Caspase-1。除此之外，MP感染A549细胞后，炎症细胞因子IL-1β、IL-18表达量上升、细胞凋亡增加，说明NLRP3炎症小体激活后，利用Caspase-1的酶活性使二者无活性的前体pro-IL-1β、pro-IL-18加工成有活性的形式分泌到细胞外，从而使得表达量上升。
RNA干扰是生物体内普遍存在的生物学现象，它能特异、高效地使靶标基因沉默。作为RNA干扰过程中间产物的siRNA[18],可经由多种不同转染技术导入细胞内，并对特定基因产生具有专一性的抑制表达效果，从而使目的蛋白表达量下调。因此我们可利用经过适当剪裁的siRNA的互补性，对NLRP3炎症小体的基因进行抑制表达，结果发现在MP感染A549细胞的基础上加入NLRP3 siRNA质粒，因MP感染升高的NLRP3炎症小体表达量、IL-1β、IL-18水平也随之降低，从基因层面说明MP感染A549细胞的确可以引起NLRP3炎症小体的活化。为了进一步QTF对NLRP3炎症小体活化的抑制作用，在MP感染A549细胞的基础上加入QTF,发现NLRP3炎症小体和IL-1β、IL-18水平下降，细胞凋亡率也降低。由于质粒(plasmid)可通过基因过表达方式使其所携带的信息高效、稳定的表达[19],所以我们还利用此方式进一步验证，结果显示使用NLRP3过表达质粒后，原本降低的NLRP3炎症小体表达量以及IL-1β、IL-18水平又呈现出上升趋势。此结果在我们所做的RT-PCR法对MP感染A549细胞mRNA检测的实验中也得到了验证，NLRP3炎症小体各组成蛋白NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA含量在受到MP感染后表达上升，使用QTF干预后下降，在基因层面上，运用NLRP3 siRNA干预后，mRNA含量降低，使用NLRP3过表达质粒干扰后含量增高。
本项目组前期研究证明清肺通络方治疗MPP疗效明显。在常规静滴阿奇霉素基础上联合用清肺通络方治疗患儿41例，临床治愈率明显上升[20-21]。机制研究发现清肺通络方抑制TH17通路的炎症因子，防治支原体引起的哮喘发作和肺纤维化[22],细胞压积，促进肺微循环[23],还可以增加和血管内皮生长因子(VEGF)表达，增加毛细血管后静脉和小静脉通透性[24]。我们在清肺通络方干预MPP血清代谢组学及相关细胞因子的研究中发现MP可诱导抗微生物防御系统，刺激炎性细胞因子大量释放，有助于MP清除的同时，减轻组织损伤、抑制细胞凋亡，降低炎症因子IL-1β、IL-18表达[25-27]。本研究进一步发现清肺通络方可以使NLRP3炎症小体各相关蛋白和下游因子IL-1β、IL-18下降。
综上，MP可以激活NLRP3炎症小体相关蛋白，并通过这一信号传导通路，使得下游炎症因子IL-1β、IL-18含量水平上升。而且使用清肺通络方的确可以降低被激活后NLRP3炎症小体各组成相关蛋白，并且有效降低因为感染而引起的体内炎症因子IL-1β、IL-18含量水平，为清肺通络方抑制MPP的作用机制提供了实验依据。
参考文献
[1] F Q CHEN,Y Z YANG,L L YU,et al.Prevalence of Mycoplasma pneumonia:A case for community-acquired infection among pediatric population[J].Nigerian Journal of Clinical Practice,2015,18(3):354-358.
[2] CHIANG W C,TEOH O H,CHONG C Y,et al.Epidemiology,clinical characteristics and anti microbial resistance patterns of community acquired pneumonia in 1702 hospitalized children in Singapore[J].Respirology,2007,12(2):254-261.
[3] KEBAIER C,CHAMBERLAND R R,ALLEN I C,et al.Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome[J].Journal of Infectious Diseases,2012,205(5):807-817.
[4] PAUWELS N S,BRACKE K R,DUPONT L L,et al.Role of IL-1α and the Nlrp3 / caspase-1/IL-1β axis in cigarette smoke-induced pulmonary inflammation and COPD[J].European Respiratory Journal,2011,38(5):1019-1028.
[5] BATEMAN E D,HURD S S,BARNES P J,et al.Global strategy for asthma management and prevention:GINA executive summary[J].European Respiratory Journal,2008,31(1):143-178.
[6] MAYOR A,MARTINON F,DE SMEDT T,et al.A crucial function of SGT1 and HSP90 in inflammasome activity links mammalian and plant innate immune responses[J].NATURE IMMUNOLOGY,2007,8(5):497-503.
[7] YAN L,DAN T,QIANNA K,et al.The Protective Effect of Naringenin on Airway Remodeling after,Mycoplasma Pneumoniae,Infection by Inhibiting Autophagy-Mediated Lung Inflammation and Fibrosis[J].Mediators of Inflammation,2018,2018:1-10.
[8] 姜永红，虞坚尔，姜之炎.从络病理论解析小儿支原体肺炎及其变证[J].上海中医药杂志，2013,47(5):27-28.
[9] SHIMIZU T,KIMURA Y,KIDA Y,et al.Cytadherence of Mycoplasma pneumoniae induces inflammatory responses through autophagy and toll-like receptor 4[J].Infect Immun,2014,82(7):3076-3086.
[10] KEBAIER C,CHAMBERLAND R R,ALLEN I C,et al.Staphylococcus aureus α-hemolysin meduayes virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome[J].The Journal of Infectious Diseases,2012,205:807-817.
[11] PAUWEL N S,BRACKE K R,DUPONT L L,et al.Role of IL-1α and the Nlrp3/caspase-1/IL-1βaxis in cigarette smoke-induced pulmonary inflammation and COPD[J].The European respiratory journal,2011,38:1019-1028.
[12] BATEMAN E D,HURD S S,BARNES P J,et al.Global strategr for asthma managemwnt and prevention:GINA executivesummary[J].European respiratory journal,2008,31:143-178.
[13] BECKER J G,SEAGREN E A.Regulation of adaptive immunity by the innate immune system[J].science,2010,327(5963):291-295.
[14] CAO W,ZOU Y,SU S,et al.Chlamydial plasmid-encoded protein pORF5 induces production of IL-1βand IL-18 via NALP3 inflammasome activation and p38 MAPK pathway[J].See comment in PubMed Commons below International Journal of Clinical and Experimental Medicine,2015,8(11):20368-20379.
[15] SUTTERWALA F S,OGURA Y,SZCZEPANIK M,et al.Critical role of NALP3/CIAS1/Cryopyrin in innate and adaptive immunity through its regulation of caspase-1[J].Immunity,2006,24(3):317-327.
[16] HACKER G,PASCHEN S A.Therapeutic targets in the mitochondrialapoptotic pathway[J].Expert Opinion on Therapeutic Targets,2007,(11):515-526.
[17] CHEN M,WANG H,CHEN W,at el.Regulation of adaptive immuni-ty by the NLRP3 inflammasome[J].Int Immunopharmacol,2011,11(5):549-554.
[18] VYLETA M L, WONG J, MAGUN B E. Suppression of ribosomalfunction triggers innate immune signaling through activation of theNLRP3 inflammasome[J].PLoS One,2012,7:e36044.doi:10.1371/journal.pone.0036044.
[19] BAUERNFEIND F,HORNUNG V.Of inflammasomes and pathogens-sensing of microbes by the inflammasome[J]. EMBO Mol Med,2013(5):814-826.
[20] BAOLING CHEN,RAN PAN,DIANA ASKHATOVA,et al.Effectivesmall interfering RNA delivery in vitro via a new stearylated cationicpeptide[J].Int J Nanomedicine,2015(10):3303-3314.
[21] ALVARO SAN MILLAN,KARL HEILBRON,R CRAIG MACLEAN.Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmidsurvival in bacterial populations[J].ISME J,2014,8(3):601-612.
[22]姜永红，虞坚尔，姜之炎．从络病理论解析小儿支原体肺炎及其变证[J]．上海中医药杂志，2013,47(5):27-28.
[23]姜之炎，姜永红，李文，等．清肺通络汤治疗儿童肺炎支原体肺炎临床观察[J]．中国中医基础医学杂志，2014,11(20):1582-1584.
[24]姜永红，姜之炎，虞坚尔．清肺通络汤对MPP小鼠Th17细胞信号途径调控作用的研究[J]．世界中西医结合杂志，2013,8(10):994.
[25]姜永红，虞坚尔，姜之炎．清肺通络方对支原体肺炎影响的实验研究[J]．中医学报，2014,29(4):487-489.
[26]史竞懿，姜之炎，卞菊．清肺通络汤对儿童肺炎支原体肺炎血液流变学影响的研究[J]．天津中医药，2013,30(6):331-333.
[27] Y H JIANG,J E YU,A H GUO,et al.Ameliorative effects of QingfeiTongluo formula on experimental mycoplasmal pneumonia in mice[J].Journal of Natural Medicines,2015,70:1-7.