霞
贵州省人民医院急诊科，贵州贵阳 550000
[摘要] 目的 运用脂质体Lipofectamine 2000转染大鼠肝星状细胞（HSC-T6），比较不同质粒与脂质体比例及不同时刻转染HSC后绿色荧光蛋白的表达，确定高表达阳性克隆G418筛选条件。方法 将细胞按质粒与脂质体的不同比例分为四组：A组（2ug：3uL），B组（2ug：4uL），C组（2ug：5uL），D组（2ug：6uL）混合后转染大鼠HSC，约24 h观察转染率，以最高转染率的质粒与脂质体混合，转染大鼠HSC，比较转染后24、48、72 h的转染率；用不同浓度G418进行筛选，确定筛选最佳浓度，通过G418筛选建立高表达EGFP的HSC-T6阳性克隆。结果 转染24 h后，各组均有绿色荧光蛋白的表达，与A、B、D组比较，C组转染率明显增高（P＜0.05），质粒与脂质体以2ug：5uL转染HSC后，随时间延长，转染后48 h转染率最高（P＜0.05），72 h有所下降，G418筛选最佳浓度为400 ug/mL，经筛选约21d后可阳性克隆，更换为正常培养液可继续培养和传代。结论 Lipofectamine 2000可有效转染HSC，经G418筛选形成阳性克隆，为基因治疗肝纤维化的研究提供依据。
[教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ] 脂质体；大鼠；肝星状细胞
[中图分类号] R78[文献标识码] A[文章编号] 1672-5654（2014）10（c）-0180-02
[作者简介] 周霞（1982-），女，汉族，贵州遵义人，硕士，主治医师，主要从事内科临床工作。
重组质粒作为研究基因功能的主要手段，目前正得到越来越广泛的应用。运用基因转染载体将质粒转染哺乳动物细胞，并可建立稳定表达目的基因的细胞株。脂质体作为非病毒转染载体，其介导的细胞转染是通过脂质体DNA复合物与细胞融合，将DNA导入细胞，具有高效、简便、对细胞损伤小和容易重复等优点。本实验自2013年10月—2014年5月运用阳离子脂质体，将重组质粒转染HSC-T6，并筛选转染阳性克隆，初步探索Lipofectamine 2000转染HSC-T6的条件及方法。
1资料与方法
1.1一般资料
大鼠肝星状细胞株HSC-T6、pcDNA3.1(+)-EGFP质粒由武汉协和医院胃肠病实验室提供。感受态大肠杆菌DH-5ɑ购自武汉晶赛生物工程技术公司，小量质粒提取试剂盒购自宁波中鼎公司，G418购自北京索莱宝生物科技有限公司，阳离子脂质体Lipofectamine 2000 购自Invitrogen 公司。
1.2方法
1.2.1 质粒的提取pcDNA3.1(+)-EGFP质粒转化大肠杆菌DH-5ɑ，扩大培养后，采用小量质粒提取试剂盒提取质粒，用紫外分光光度计测定浓度，调整质粒浓度为1ug/ul，过滤灭菌备用。
1.2.2 细胞培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6在含15%胎牛血清（FCS）的DMEM液，置于37℃，体积分数为5%CO2孵育箱中培养。转染前一天，将HSC-T6细胞接种于6孔培养板，每孔2×105个细胞，过夜培养后，按质粒与脂质体比例分为四组：A组（2ug：3ul），B组（2ug：4uL），C组（2ug：5uL），D组（2ug：6uL）。
1.2.3 细胞转染取一试管加入pcDNA3.1(+)-EGFP质粒，用250uL Opti-MEM 培养基混合稀释，另取试管分别加入3uL，4uL，5uL及6uL Lipofectamine 2000，用250uL Opti-MEM培养基混合稀释，室温无菌条件下放置5 min，将质粒分别与不同剂量Lipofectamine 2000混合后放置20 min，每孔加入量为500 uL混合液培养4 h，更换培养液继续培养，4 h后记数10个200倍视野下发绿色荧光的细胞及同视野光镜下细胞数计算转染率，确定质粒与脂质体转染的最佳比例，按质粒与脂质体最佳比例转染HSC-T6，观察转染24、48、76 h转染率，各组细胞设置三个复孔。
1.2.4 G418筛选将HSC-T6接种于24孔板中，每孔2×105个细胞，培养过夜后，分别加入含100、150、200、250、300、350、400、500、700 ug/mL，800ug/lG418培养基，15%FCS的DMEM培养液2ml，观察15 d后细胞全部死亡的G418最低浓度，实验均重复三次。
1.2.5 G418筛选阳性克隆将HSC-T6细胞接种于6孔培养板，每孔2×105个细胞，过夜培养后，按细胞转染方法，将pcDNA3.1(+)-EGFP与Lipofectamine 2000按最佳比例转染HSC，4h后改用含G418培养基进行筛选，筛选出阳性克隆后，更换为正常培养液继续培养和传代。
1.3 统计学分析
记量资料用均数±标准差表示，应用SPSS 17.0软件处理，数据显著性检验用方差分析，并进行两两比较。
2结果
2.1细胞转染及转染率的观察
将pcDNA3.1(+)-EGFP与Lipofectamine 2000以2ug：3uL，2ug：4uL，2ug：5uL及2ug：6uL转染HSC-T6，24 h后均可见绿色荧光蛋白的表达，与A、B、D各组比较，C组转染率明显增高（P＜0.05见表1）。
2.2不同时间点转染率的观察
将pcDNA3.1(+)-EGFP与Lipofectamine 2000以2ug：5uL转染HSC-T6后，24 h即可见绿色荧光蛋白表达，48h绿色荧光蛋白表达最高，72 h则有所下降，48 h时转染率较24 h明显增高（29.22±1.14 vs 19.47±4.16 P＜0.05），与72 h比较无明显差异（29.22±1.14 vs 24.66±2.00 t=7.764，P=0.088）。
2.3脂质体Lipofectamin 2000对细胞的毒性作用和G418筛选
应用Lipofectamine 2000转染HSC-T6后镜下观察显示，在5uL的用量下，HSC-T6细胞未见明显细胞死亡表现。筛选结果显示：当细胞更换为含G418的培养基后，随G418浓度升高，时间延长，各孔均可见细胞死亡，6 d后，500ug/mL浓度以上细胞全部死亡，筛选15 d后，细胞全部死亡最低浓度为300ug/mL。
2.4阳性克隆的筛选
pcDNA3.1(+)-EGFP与Lipofectamine 2000比例为2u：5uL转染HSC-T6 4 h，改用含400ug/mlG418培养基，15%FCS的DMEM培养液2 mL，6 d后细胞大部分死亡，G418浓度减至200ug/mL维持筛选，残存细胞约14d后形成阳性克隆（图1）。
3讨论
基因转染技术在生物学研究领域和临床应用都已取得了很大的进展。目前使用的基因传递载体有病毒载体和非病毒载体两类[1]。阳离子脂质体作为非病毒载体，在基因转染中得到广泛应用[2-3]。HSC作为肝纤维化发病的关键环节倍受关注，以HSC为靶标的治疗措施逐渐成为抗纤维化的重要方法[4]。较多实验通过基因转染的方法，体外研究HSC激活机制或抗纤维化机制的研究，但其转染条件及方法仍需进一步研究。本实验运用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将pcDNA3.1(+)-EGFP质粒转染HSC，24 h后可见绿色荧光蛋白表达情况，说明Lipofectamine 2000可成功转染HSC-T6。
国外研究已证实，脂质体的转染率除外与阳离子脂质体的构型有关外，还与阳离子脂质体与DNA的比例，脂质体复合物的结构，脂质体复合物的剂量等有关[5-6]。脂质体/DNA复合体的大小和形状受阳离子脂质体和DNA的摩尔比影响，脂质体与DNA的电荷比在１∶１时，则有明显的大小及结构的改变，形成的复合体的粒径最大，在体内的半衰期延长，基因转染效率最高[7-8]。我们将质粒与不同剂量脂质体混合转染HSC-T6，当质粒与Lipofectamine 2000比例为2ug：5uL时，转染率最高，同时，观察转染24、48及72 h后绿色荧光蛋白的表达，发现随着时间延长，转染率有所增高，48 h转染率最高，72 h后绿色荧光蛋白的表达有所下降。基于本研究，推测质粒与Lipofectamine 2000比例为2ug：5uL时，脂质体与DNA电荷比接近1：1，可获得最佳转染率，但随着时间的延长至72 h，绿色荧光蛋白的表达会有所下降，目的基因不能得到稳定的表达。
为了目的基因得到稳定表达，可根据质粒上带有的耐药基因而选择相应药物进行筛选，建立稳定转染细胞株，目前最常用的方法是G418筛选。HSC-T6细胞系经G418筛选15 d后，细胞全部死亡最低浓度为300ug/mL，确定筛选浓度为400ug/mL，维持筛选浓度为200ug/mL。将pcDNA3.1(+)-EGFP与Lipofectamin 2000比例为2u：5uL转染HSC-T6 4 h后，通过G418筛选，约20 d后可形成阳性克隆，并可正常培养和传代。
本研究证实：Lipofectamine 2000可高效转染大鼠肝星状细胞系HSC-T6，当质粒与脂质体比例为2ug：5uL可获得最高转染率，G418筛选可获得基因稳定表达的细胞克隆，本实验为运用该细胞系进行基因转染方面的研究，尤其是运用稳定表达目的基因的细胞系开展肝脏疾病，特别是肝纤维化方面的研究奠定基础。
[教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献]
[1]Weiwei Wang,Wenzhong Li,Nan Ma,et al.Non-Viral Gene DeliveryMethods[J].Current Pharmaceutical Biotechnology,2013（14）:46-60.
[2]Kai K Ewert,Alexandra Zidovska,Ayesha Ahmad,et al.Cationic Liposome-Nucleic Acid Complexes for Gene Delivery and Silencing:Pathways and Mechanisms for Plasmid DNA and siRNA[J].Top Curr Chem，2010,296:191-226.
[3]Caracciolo G,Amenitsch H.Cationic liposome.DNA complexes:from structure to interactions with cellular menmbranes[J].Eur Biophys J,2012,41(10):815-829.
[4]Kang JH,Toita R,Murata M.Liver cell-targeted delivery of therapeutic molecules[J].Crit Rev Biotechnol,2014（15）:1-12.
[5]Chen JL, Wang H, Gao JQ, et al. Liposomes modified with polycation used for gene delivery: preparation, characterization and transfection in vitro[J].Int J Pharm,2007,343(1-2):255-261.
[6]Obata Y,Ciofani G,Raffa V,et al.Evaluation of cationic liposomes composed of an amino acid-based lipid for neuronal transfection[J].Nanomedicine, 2010,6(1):70-77.
[7]Majeti BK, Karmali PP, Reddy BS, et al.In vitro gene transfer efficacies of N,N-dialkylpyrrolidinium chlorides:a structure-activity investigation[J].J Med Chem,2005,48(11):3784-3795.
[8]Yang Y,Zhang Z,Chen L,et al.Effect of multifold charge groups and imidazole-4-carboxadehyde on physicochemical characteristics and transfection of cationic polyphosphazenes/DNA complexes[J].Int J Pharm,2010,390(2):191-197.
（收稿日期：2014-08-13）