摘 要：临床上对于骨形成有着较大的需求，如骨质疏松，骨折，颅骨缺损等。虽然已经出现了生物材料和自体或异体骨移植等治疗途径，但仍存在一些应用限制及并发症。而近几年，细胞外囊泡特别是外泌体的发现，为骨形成提供了新的思路。特别是源自干细胞的外泌体已显示出促进成骨的巨大潜力。本文主要讨论了外泌体的基本概念，其主要分离和鉴定技术以及干细胞来源的外泌体在骨形成作用中研究进展和潜在临床应用。
关键词：细胞外囊泡;外泌体;干细胞;骨形成;
在临床中，即使是最常见的骨折，缺乏有效充分的骨形成也可能导致不良预后。据研究报道，2%到10%的骨折可能由于骨生长不足而发生骨不连[1]。医疗美容中往往会遇到骨缺损修复、骨软骨愈合等问题，而临床修复超过临界大小的骨缺损仍然是个较大挑战，面临着迟愈合或不愈合的风险[2]。同时人口老龄化加剧了这种情况。衰老不仅会由于骨密度降低而导致较高的骨折风险，同时也会降低机体骨形成的能力[3]。因此，如何有效修复骨质缺损、促进骨形成仍然是临床医生面临的主要挑战。临床上广泛使用自体和异体骨移植来促进骨形成。自体骨移植物采用自体松质骨、皮质骨或骨髓抽取物，被认为是治疗骨折、延迟愈合、防治骨不连的金标准手段[4]。但是，自体骨移植有着较多并发症如供骨区域感染、出血，移植部位的感染、骨吸收等[5]。有研究表明约20%–30%的接受自体骨移植的患者移植骨吸收现象明显，在移植部位出现再次缺损[6]。此外，自体骨移植往往不能为具有较大缺损的患者提供足够的移植骨量[7]。而同种异体骨移植后，超过30%的患者出现并发症，包括免疫反应、异体骨骨折，骨不连和感染[8,9]，从而导致骨形成量不足，修复效果不佳。
目前生物材料和细胞疗法是促进骨形成的主要研究领域。但是，两种治疗方法都有各自的缺点。生物材料的潜在毒性和免疫原性可能导致严重的并发症，而细胞疗法可能导致肿瘤和栓塞的形成[10]。而如今，具有较低安全顾虑和较好促进成骨能力的外泌体，为研究人员提供了一种刺激骨形成的新思路。
1 外泌体的概念
大多数真核细胞都会分泌与细胞间通讯相关的细胞外囊泡。这些高度异质的膜封闭结构可能对邻近和远处的细胞都有影响。细胞外囊泡可分为三个类型，分别是凋亡小体，微泡和外泌体[11,12]。
细胞外囊泡根据其大小进行分类，其中直径约为30-150nm的细胞外囊泡群体被称为“外泌体”[13,14]。它们能在大多数体液中被提取(例如：血液，乳汁，唾液，精液，尿液)，并且几乎能从所有哺乳动物细胞类型中纯化获得(例如：内皮细胞，神经元细胞，肌肉细胞，干细胞等)[11,15,16]。这些具有生物活性的外泌体含有脂质，蛋白质，以及具有功能活性的核糖核酸(如：mRNA，miRNA)。现有的研究表明，上述这些物质是细胞在多种生物学事件(如：细胞间通讯，蛋白质和核酸的运输，肿瘤发生，代谢)中起作用的重要介质，它们在不同疾病的诊断和治疗中也具有广泛的应用前景[16,17]。尽管外泌体具体如何参与细胞间通讯尚未有深入研究。但有研究表明，外泌体参与细胞间通讯的机制涉及受体-配体相互作用[18,19]。
2 外泌体的分离和鉴定
为了从各种体液或培养细胞的上清液中分离出外泌体，已经研发了几种分离技术。这些分离技术利用了外泌体的某些特征，例如其大小，形状，密度和表面蛋白，以使其纯化分离。常被应用的技术包括超速离心，超滤，聚合物沉淀，亲和色谱法等[20,21,22,23]。
其中超速离心是用于外泌体提取的最广泛使用的分离技术，被认为是外泌体提取的“金标准”[24]。超速离心根据其大小和密度差异将外泌体与其他组分分离。包括：1、低速旋转(300–500 RCF)以除去细胞和凋亡碎片;2、高速旋转(1000–20000 RCF)以消除较大的囊泡;3、超速离心(100000–150000 RCF)分离外泌体。超速离心是一种基本不改变外泌体性质的纯物理提取方法，但是这种分离技术存在需要的仪器较为精密复杂、耗时较长、提取量有限等缺点[25,26]。为了提高获得外泌体纯度并减少离心时间，可以在最后一步后进行额外的纯化，例如蔗糖梯度离心[27]。
聚合物沉淀是一种有效、可靠，能够替代耗时较多的超速离心的方法[28]。通过调节外泌体的溶解度和分布，它们可以从体液中沉淀出来。目前，几种外泌体提取试剂盒(例如ExoQuick试剂盒，总外泌体分离试剂盒等)已被研发，其使用不含水的聚合物(例如聚乙二醇)结合水分子，使溶液中不易溶解外泌体颗粒沉淀从而以较少的时间获得可观量的外泌体，能够做到简单可靠地提取外泌体[28,29]。
在提取到外泌体之后，需要对其做鉴定，通常可以基于囊泡数量，表面生物标志物，大小，电势等，通过蛋白质印迹，PCR等手段来鉴定提取的外泌体，同时透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和纳米粒子跟踪分析(NTA)也是外泌体鉴定手段之一[30]。但是当使用TEM和SEM检测外泌体时，对样品的脱水可能会导致外泌体的形态变化，是其应用的主要限制[31]。
3 干细胞来源的外泌体在骨形成方面的作用
在过去的几年中，外泌体在骨组织修复和再生领域受到了广泛的关注，许多研究表明，与骨相关的细胞，如破骨细胞，成骨细胞，骨细胞和骨髓间充质干细胞，也释放外泌体[32]。通过将生物活性分子转移至靶细胞，有利于破骨细胞和成骨细胞的分化。外泌体特别是干细胞来源的外泌体单独或结合载体使用，可有效恢复或促进生物体骨形成能力[33,34]。
Qin等人的研究发现骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体上调成骨细胞中成骨基因ALP，OCN，OPN和RUNX2的表达，促进成骨，并且这可能通过MAPK途径介导[35]。Zhang等人的研究证明间充质干细胞(MSCs)来源的外泌体通过多方面机制启动骨缺损的快速修复和再生，该机制协调几种细胞过程的调节，如迁移，增殖，基质合成，巨噬细胞浸润和细胞因子的产生等；同时MSC外泌体确实可以在一小时内诱导软骨细胞中AKT和ERK的快速磷酸[36]。在一些特殊原因导致的骨质缺损情况下，干细胞来源的外泌体也有较好的促进骨形成作用，Liu等人发骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体可通过携带Fas蛋白进入红斑狼疮(SLE)模型小鼠的BMSCs中，降低miR-29b的细胞内水平，从而导致Dnmt1介导的Notch1启动子低甲基化的恢复，进而改善SLE模型小鼠BMMSC功能，促进成骨[37]。而对于骨质疏松引起的骨缺损，(人诱导多能干细胞)hiPSC-MSC来源的外泌体有效地刺激rBMSCs-OVX的增殖和成骨分化，其效果随着外泌体浓度的增加而增加[38]。Nakao的研究表明，用疾病相关刺激对BMSCs进行适当的预处理可以优化外泌体的含量，从而有效地支持特定疾病的修复[39,40]，如使用TNF-α处理的BMSCs来源外泌体可以更有效抑制骨吸收，促进骨形成[39]。
生物材料与外泌体的结合能够更好地发挥外泌体的促进骨形成作用，与纯磷酸三钙支架相比，含有人诱导多能干细胞的间充质干细胞(hiPS-MSC)来源的外泌体的磷酸三钙支架具有更强的成骨作用，其可能通过激活PI3K / Akt信号通路来增强hBMSCs的增殖、迁移和成骨分化[41]。hiPSC-MSC-Exos +β-TCP支架的应用与卵巢切除大鼠模型中，可增强血管生成和骨生成进而促进了颅骨缺损中的骨再生[38]。也有研究表明，BMP2刺激的巨噬细胞分泌的外泌体可以调节BMSCs的成骨分化，而以钛纳米管作为载体运输外泌体能够对BMSCs分化进行时间调节，并可以招募多种细胞因子，诱导有利成骨环境[42]。外泌体不仅对骨缺损有促进成骨作用，对于软骨修复也有一定的促进作用，外泌体处理的缺陷在12周后显示软骨和软骨下骨已完全恢复，且具有表面规则的透明软骨，与邻近软骨完全结合。相反，在对侧PBS处理的缺陷中仅发现纤维修复组织[43]。
有研究表明，在外泌体发挥作用的过程中，其中的RNA成分可能扮演了重要角色[44]。Xu等人发现骨髓间充质干细胞来源的外泌体包含miR-302b，miR-203，miR-218，miR-148a，miR-135b，miR-199b，miR-219，miR-299-5p，可能存在促进成骨的作用[45]。Furuta等的研究表明在骨折愈合期间骨髓干细胞来源的外泌体表达mRNA和miRNA来促进骨愈合；同时外泌体还可能分泌若干基因(miRNA-196A，miRNA-27A和miRNA-206)来增强成骨细胞增殖和分化[46]。此外，除了骨源性的外泌体之外，内皮干细胞来源的外泌体注射至骨缺损部位，相对于对照组可以更有效修复骨缺损、促进骨形成，并且在2-4周的骨重建过程中骨组织质量获得显著改善[47]。