基金项目：佛山市卫生局医学科研立项 （编号：2014228）
李庆贤种树彬叶艳芬李堃晹周婉云：佛山市南海区人民医院广东佛山528200
96例扁平疣HPV基因型的检测分析
李庆贤种树彬叶艳芬李堃晹周婉云
ANALYSIS OF THE HPV GENOTYPES OF 96 PATIENTS WITH FLAT WART
LI Qingxian, CHONG Shubin, YE Yanfen, et al
【摘要】目的
通过检测了解扁平疣HPV基因型感染情况，为临床治疗提供依据。方法
选择我院皮肤科2014年1月～2014年6月收治的96例扁平疣患者为研究对象，通过聚合酶链反应相关技术对所有患者皮肤组织行HPV基因型检测，记录不同HPV基因型感染情况。结果
96例患者中检出HPV基因型92例（95.83%），HPV亚型共5种，检出率最高的是HPV11（63.54%），其次是HPV18（39.58%），最低的是HPV58（4.17%）。另外，HPV基因型单一感染率60.42%，二重感染（HPV11+HPV18、HPV11+HPV6、HPV11+HPV59）率32.29%，三重感染（HPV11+HPV6+HPV59）率3.13%。结论我院扁平疣检测HPV基因型以HPV11为主，HPV18等高危型HPV多以混合感染形式存在。
【关键词】扁平疣人乳头瘤病毒基因型HPV感染检测
【Abstract】Objective
To provide the basis for clinical treatment by detecting the HPV genotype infections of flat warts. Methods
Admitted to the dermatological department of our hospital from January 2014 to June 2014, 96 patients with flat wart were selected. Based on the polymerase chain reaction related technology, the skin tissues of all patients underwent HPV genotype detection to record different HPV genotype infections. Results
Among the 96 patients, HPV genotypes were found in 92 patients (95.83%). The detected HPV subtypes had five kinds, and the detection rate of HPV11 was highest (63.54%), followed by HPV18 (39?58%), and the detection rate of HPV58 was lowest (4.17%). In addition, single HPV genotype infection rate was 60.42%, and double infection rate (HPV11 + HPV18, HPV11 + HPV6, HPV11 + HPV59) was 32.29%, and triple infection rate (HPV11 + HPV6 + HPV59) was 3.13%. ConclusionThe detected HPV genotype of flat warts is mainly HPV11 in our hospital. The HPV18 and other high-risk HPV infections are mainly mixed infection.
【Key words】 Flat wart; Human papillomavirus; Genotype; HPV infection; Detection
【Author′s address】People´s Hospital of Nanhai District, Foshan 528200, Guangdong Province, China
doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.07.034
扁平疣作为临床一种常见病毒性皮肤病，主要由HPV（人乳头瘤病毒）感染引起，在颜面、手背等部位分散分布，具有病程较长、易传染、通常无自觉症状等特点。机体免疫功能缺陷状态下及外伤等因素是引起病毒感染的主要原因［1］。该皮肤疾病不但会影响患者外观，而且会增加患者及其家属的心理负担。依据DNA同源性，当下已发现100多种HPV感染与扁平疣发生有关，如HPV2、3、28、65型等［2］，且目前关于扁平疣治疗文献研究较多，但对其HPV感染基因型检测研究相对较少。基于此，本研究利用聚合酶链反应相关技术对我院2014年1月～2014年6月收治的96例扁平疣患者HPV感染基因型进行检测，为临床治疗方案制定提供参考。报告如下。
1资料与方法
1.1临床资料选择我院皮肤科2014年1月～2014年6月收治的扁平疣患者共96例，纳入标准：①符合扁平疣临床诊断标准，于颜面、手背等部位发作，皮肤损害呈现淡红、绿豆大小、不规则形状、表面光滑等特点；②多数无自觉症状，少数伴有瘙痒症状；③自愿参与本次研究。排除标准：①治疗前1个月内口服及外用药物；②肝肾功能不全；③有神经、精神性疾病或其他各类慢性疾病；④妊娠及哺乳期妇女或计划年内怀孕的患者；⑤影响免疫系统相关疾病；⑥对所用药物有过敏史的患者。其中男52例，女44例，年龄11～41岁，平均（24.4±7.3）岁，病程2个月～4年，平均（13.5±3.9）个月，皮损数目6～45个，平均（20.9±4.8）个。
1.2方法
1.2.1采集标本对需采集皮肤部位消毒，将采集到的疣体组织于专用灭菌管中放置，保存在-20℃冰箱中等待检测。
1.2.2设备与试剂DNA提取试剂盒、HPV分型检测试剂盒（凯普）、HPV基因分型检测试剂盒-PCR试剂盒、PCR扩增仪、琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒、凝胶成像仪、紫外线投射放射分析仪。
1.2.3检测方法通过聚合酶链反应相关技术检测20种HPV亚型，包括HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68。检测步骤如下：①HPV DNA提取、测定。a/引物合成。扩增HPV L1片段大小450 bp左右。内参β-actin上游引物、下游引物分别为5?-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3?、5?-CTTCCTTAATGTCACGACGATTTC-3?,扩增片段大小540 bp左右；随后根据DNA提取试剂盒使用说明术操作，将DNA提取出。b/PCR反应（包括上下游引物、缓冲液等），相关参数：温度94℃，加热5 min后进入循环（94 ℃变性、55 ℃退火、72 ℃延伸，时间均为30s，循环35次，然后72 ℃延伸8 min）。c/产物测定。通过凝胶成像仪对PCR产物鉴定，随后经由紫外线投射反射分析仪操作分析阳性标本，根据琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒使用说明书将目的片段回收。②通过PAGE（聚丙烯酰氨凝胶电泳）等方法对PCR产物进行酶切：PAGE电泳中放置酶切产物，100V电泳90 min，行EB（溴化乙锭）染色，随后通过凝胶成像仪观察结果，以酶切片段数量、大小为依据行HPV DNA分型。③HPV基因型鉴定。通过PCR直接测序法对不常见HPV型别或难以分辨的图形进行鉴定，纯化PCR产物后经由DNA序列自动分析仪完成正反双向测序，将测定结果与GenBank中HPV序列对照组，若和已知HPV序列符合率超过90%，提示为该型HPV。同时观察HPV基因型感染情况，若目的片段为1，则为单一感染，多个目的片段则为多重感染。
2结果
2.1HPV DNA基因型检测结果96例患者中检出HPV DNA基因型92例（95?83%），且检测出的HPV DNA基因型为HPV6、HPV11、HPV18、HPV58、HPV59，分别占17?71%、63?54%、39?58%、4?17%、8?33%。其他15种HPV 基因型未发现。见表1。
2.2HPV感染情况96例患者中HPV基因型阳性92例，其中HPV单一型感染58例（60?42%，58/96），HPV基因型二重感染31例（32?29%，31/96），HPV基因型三重感染3例（3?13%，3/96）。见表2。
3讨论
扁平疣主要是由人乳头病毒感染引起的一种常见皮肤病，临床治疗以抗病毒、提高患者免疫能力等为主。但受HPV感染严重程度、分型、病情严重程度等多种影响，药物治疗疗程一般较长且疗效不是很理想［3-4］。基因学相关研究表明，目前临床有100多种类型的HPV感染与扁平疣的发生密切相关，主要有HPV2、3、4、5、10、28、41、65、126型等。而目前国内外针对HPV16、18的感染机制及致癌性研究较多，对上述扁平疣相关HPV感染机制的研究仍非常缺乏。既往研究认为，皮肤受损是扁平疣发生的一个诱因，且扁平疣的发生、发展和消退均与机体的免疫系统有关，免疫力缺陷可导致疣持续时间较长，甚至出现疣体几乎不能自然消退的现象。而且，HPV生长繁殖的整个过程均在表皮层，并随着表皮细胞的分裂、分化、成熟及脱落，在基底细胞层抗原呈低水平表达，在分化成熟的表皮细胞呈高表达，这使得感染的角质细胞难以与循环免疫细胞接触，导致机体免疫系统不能产生快速有效的免疫应答，致使病情持续不愈［5］。为此加强HPV基因型检测对扁平疣等疾病治疗方案制定具有十分重要的意义。
HPV有低危型、高危型之分，前者主要表现在肛周部位外生性疣类病变、低度子宫上皮内瘤等疾病，而后者在生殖器癌、宫颈癌等严重疾病中比较常见［6］。目前检测HPV基因型常见手段有杂交捕获技术、基因芯片技术、斑点杂交、southern blots等，其中southern blots被认为是HPV分型检测的“金标准”，敏感性及特异性均较高，但其不足之处在于操作复杂、检测时间较长，临床应用受限；斑点杂交具有操作简单、检测快速等特点，但敏感性相对比较低，且需多步骤杂交过程才能确定为某一HPV型感染，也难以在临床上推广；而杂交捕获技术、基因芯片技术需通过特异性探针或引物才能对已知的HPV型检测，而对未知或难以辨别的HPV型难以测定分型。为此本研究通过聚合酶链反应相关技术对96例扁平疣患者HPV基因型检测，该技术属于分子检测方法，能快速识别DNA多态性，主要是通过限制性内切酶将个体基因组DNA切割后，同源序列的酶切片段存在一定的差异，主要表现为酶切片段长度及数目上，在物种遗传分析、辅助选择标记、未知基因检测中有突出优势［7］。本研究对20种HPV基因型进行检测，发现96例扁平疣患者中有92例为HPV基因型阳性，具体体现在HPV6、HPV11、HPV18、HPV58、HPV59上，而其他HPV基因型未检出，其中检出率最高的是HPV11，随后依次是HPV18、HPV6、HPV59、HPV58，其中HPV11、HPV6属于低危型HPV，剩余三种HPV型为高危型，提示我院扁平疣患者以低危型HPV11、6为主。本研究表2中可知我院扁平疣患者以HPV单一感染为主，占60?42%，多重感染以二重感染为主，尤其是HPV11+HPV18，检出率17?71%，而高危型HPV59以混合感染形式存在，且低危型HPV11在多重感染中均有所参与。林新瑜［8］等人通过核酸分子快速导流杂交基因芯片技术检出92例扁平疣患者以HPV11为主，且发现四川地区扁平疣高危型HPV感染多数参与混合感染。何泳洁［9］等人通过PCR扩增对皮肤疣体样本HPV分型及感染情况检测，发现皮肤疣感染以HPV2为主，且多重感染率50%以上（67?4%），同时表明遵义地区扁平疣感染从高到低分别为HPV2、HPV10、HPV3、HPV1，而其他疣以HPV2、HPV1为主。本研究扁平疣患者HPV感染以HPV11、HPV18为主，这可能与地区、患者病情严重程度、具体病因等有关。
综上所述，我院扁平疣检测HPV感染基因型以HPV11为主，以单一感染为主，高危型HPV多参与多重感染。
参考文献
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［8］林新瑜,陈静宇,王芳,等.扁平疣患者人乳头瘤病毒基因型的检测分析［J］.中国美容医学,2013,22(1):69-71.
［9］何泳洁,曹碧兰,汪治国,等.132例皮肤疣组织人乳头瘤病毒分型检测［J］.中华皮肤科杂志,2012,45(7):515-516.