◆江苏省南京市天印高级中学 倪同亮
【摘 要】一个完整的基因表达载体上除了目的基因外，还必须有启动子、终止子及标记基因等，如果目的基因自带启动子，是不是就不需要加启动子呢？构建基因表达载体时，用同一种限制酶酶切含目的基因的DNA片段和载体是不是最佳选择？文章主要就这两点进行分析归纳，旨在提高课堂授课效率，提升学生的应试能力。
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关键词 基因表达载体；限制酶；黏性末端；平末端；启动子；乳腺生物反应器
中图分类号：G633.91 文献标识码：A 文章编号：1671-0568（2015）15-0100-02
新课程实施已逾十年，伴随着教与学、学与考，高中生物课程知识体系及高考的考察重点已趋于明朗化。如近几年全国各地高考卷频繁对选修Ⅲ“基因工程”这一知识点进行考察，尤其对“基因表达载体的构建”这一核心步骤中所涉及的诸多问题的考查可谓层出不穷。本文从自身教学实践出发，认为应强化以下两点的教学：
一、关于启动子的选择
构建基因表达载体的目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用，所以在一个完整的基因表达载体上除了目的基因外，还必须有启动子、终止子及标记基因等。一个基因包含编码区和非编码区，启动子位于编码区上游非编码区序列，它是RNA聚合酶识别和结合部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终翻译获得所需要的蛋白质。那么，启动子的选择有要求吗？
我们知道获取目的基因的方法有从基因组文库中获取、有人工合成：如反转录法（cDNA文库）、PCR、直接合成等。人工合成的目的基因往往不含启动子、终止子等，这就必须在构建基因表达载体时加入启动子，否则转录无法启动。问题是加入的一定是原目的基因中的启动子吗？另外，如果是从基因组文库中获取的目的基因是含启动子的，那么，在构建基因表达载体时，是不是就无需加入启动子呢？
人教版选修三《现代生物科技专题》第21页在讲述动物基因工程应用前景时，提到用转基因动物生产药物。将药物蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的受精卵中，将受精卵送入母体，使其发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁生产所需要的药品，称为乳腺生物反应器。请注意：基因表达载体上的启动子并不是药用蛋白基因自带的启动子，而是乳腺蛋白基因的启动子，这也体现了有些启动子具有特异性，如乳腺蛋白基因的启动子只会在乳腺细胞中启动基因的转录，从而使得药用蛋白基因能在乳腺细胞中成功特异性表达，以此从乳汁中获得药用蛋白。
二、关于限制酶的选择
在构建基因表达载体时，其核心是将目的基因与载体结合，而结合是否符合要求，限制酶的选择至关重要。限制酶的作用是识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。DNA经限制酶酶切产生的DNA片段通常有两种形式——粘性末端和平末端。
人教版选修Ⅲ教科书第11页写到用同一种限制酶分别切割目的基因与载体，因为切割后能产生相同的黏性末端，末端之间能发生碱基互补配对而形成重组DNA分子，但此方法是最佳选择吗？ 结合近几年高考试题和教学实践，就限制酶选择的优缺点归纳如下：
1.单酶切（用同一种限制酶酶切）的优缺点。如教材所述，用同一种限制酶分别切割含目的基因的DNA片段与载体。这是最易操作的一种方法，含目的基因的DNA片段与载体在同种限制酶作用下会形成相同的黏性末端，这两个黏性末端通过碱基间的互补配对而连接，进而形成重组DNA分子，但存在着明显的缺点：①酶切后的载体与目的基因在DNA连接酶作用下会发生自身环化。原因是酶切后的目的基因和载体的两端各有一个黏性末端，这两个末端会发生碱基互补配对而使目的基因和载体都会发生首尾相连，从而形成环状DNA分子（载体—载体连接和目的基因—目的基因连接），甚至出现多个载体、多个目的基因连接而成的环状DNA分子，这就加大了筛选的工作量。②目的基因与载体的反向连接。目的基因的插入是要有正确的方向才能正确表达（转录），如果载体和目的基因的酶切使用的是同一种限制酶，那么，目的基因的插入有两种可能：一种是目的基因的最前端刚好插在启动子下游，这样可以正确表达；另一种刚好相反，目的基因的末端插在启动子的下游（目的基因旋转180度），目的基因则无法表达或表达错误。这两种重组DNA分子，其中只有一种是我们所需要的，同样也加大了筛选的工作量。
2.多酶切（用两种或两种以上的限制酶酶切）的优缺点。用两种或两种以上的限制酶去切割含目的基因的DNA片段和载体，较常见的是用同一组两种限制酶去切割含目的基因的DNA片段和载体，两者都会产生具有两种不同的黏性末端的DNA片段，黏性末端间通过碱基互补配对从而形成重组DNA分子。
多酶切的优点是可以克服单酶切的两大缺点：一是多酶切后目的基因与载体的两侧的黏性末端不相同，因此不会发生自身环化（载体—载体连接和目的基因—目的基因连接）现象。二是可实现目的基因与载体的定向连接。如紧靠启动子下游的是EcoRⅠ位点（GAATTC），而BamH1位点(GGATTC)在后面；目的基因的前端是EcoRⅠ位点，末端是BamH1位点，酶切之后插进去，就可以保证目的基因的前端刚好插到紧靠着启动子的下游，且只产生一种重组DNA，目的基因实现定向插入，这样就可以正确表达。
当然，多种酶酶切的缺点同样存在，用多种酶切割，由于每种限制酶的最适作用条件往往不同（如最适温度、pH值等），所以一般不能将两种酶放在同一环境中使用，而是要进行两次操作，需更换培养液，以保证酶的高效性。因此，使用多酶切的方法在实际操作中较单酶切要复杂得多。
3.慎重选择切割出平末端的限制酶。如果备选的限制酶酶切产生的末端是平末端，则可用相同或不同的限制酶分别切割含目的基因的DNA片段和载体，因为即使是两个不同的平末端，在DNA连接酶的作用下也可以任意连接。此方法的优点不需要含目的基因的DNA片段和载体具有相同的限制酶识别序列，减少了对载体的挑选和改造的工作量。但在实践中，极少用平末端，因为平末端的连接效率比较低，且也会出现目的基因—目的基因、载体—载体的自身环化现象及目的基因和载体的反向连接现象。一般只有在找不到合适切成黏性末端的酶切位点而有平末端切口的情况下才使用。
教师的教学是一个不断积累的过程，积累来自于自身的学习、来自于高考试题的感悟、来自于学生课堂的质疑……我们不可一成不变地照本宣书，而应该做一个发现者、改革者，只有这样才能符合学生的认知规律，才能拓展学生的思维空间，才能提升学生的综合素养。
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参考文献：
[1]朱正威,赵占良.普通高中课程标准实验教科书生物选修3[M].北京:人民教育出版社,2010:11-21.
[2]周荷静.限制酶的多种切割方法及其在高考题中的体现[J].中学教学参考,2012,(9).
（编辑：朱泽玲）