周毅 任国敏 杨聪慧 任春霞 孟庆鹏
【摘要】 目的 本研究旨在探讨microRNA-9-3（miR-9-3）在慢性淋巴细胞性白血病骨髓细胞中的甲基化异常及其意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）技术检测8例正常骨髓组织、78例新确诊的慢性淋巴细胞性白血病患者和7种白血病细胞株甲基化水平。结果正常对照组miR-9-3呈未甲基化状态；7种白血病细胞株中有5种呈未甲基化状态（71.4%）；78例慢性淋巴细胞性白血病患者中65例呈miR-9-3甲基化，MSP阳性率为83%。5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-AzaDc）处理白血病细胞株后I83-E95和WAC3CD5+细胞株miR-9-3呈未甲基化状态。结论慢性淋巴细胞性白血病患者存在miR-9-3表达受抑，可能与其基因甲基化异常有关。而miR-9-3甲基化在激活慢性淋巴细胞性白血病患者NF-κB1信号通路的作用值得进一步研究。
【关键词】慢性淋巴性白血病 miR-9-3 甲基化特异性聚合酶链反应 5-氮杂-2′-脱氧胞苷
【Abstract】Objective This study is aim to explore the abnormal expression of microRNA-9-3 （miR-9-3） in chronic lymphocytic leukemia and its significance．MethodMethylation of miR-9-3 was studied in eight cases normal bone marrow tissue，seventy-eight diagnostic chronic lymphocytic leukemia samples， and seven chronic lymphocytic leukemia cell lines by methylation-specific polymera-se chain reaction （MSP）. ResultmiR-9-3 was unmethylated in normal controls， but methylated in five of seven chronic lymphocytic leukemia cell lines （71.4%）. Among the 78 case with chronic lymphocytic leukemia， 65 case were detected miR-9-3 methylation and the positive rate of MSP is 83%. Whereas， miR-9-3 showed an unmethylated status in the lymphocytic leukemia cell lines， I83-E95 and WAC3CD5+ cells with 5-Aza-2′-deoxycytidine （5-AzaDc） treatment. ConclusionThe underexpressed of miR-9-3 might be relative to its abnormal methylation. The role of miR-9-3 methylation in the constitutive activation of NFκB1 signaling pathway in chronic lymphocytic leukemia needs to be further study.
【Key words】 Chronic lymphocytic leukemia， MiR-9-3， Methylation-specific polymerase chain reaction （MSP）， 5-Aza-2′-deoxycytidine（5-AzaDc）
【Author′s address】Department of Clinical Laboratory， The People′s Hospital of ShangZhi， Shangzhi， Heilongjiang， China， 150601
doi：10.3969/j.issn.1671-332X.2014.10.005
DNA甲基化是指通过化学修饰在DNA甲基转移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基（-CH3）基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤（CpG）二核昔酸胞嘧啶的5′位碳原子上，导致5-甲基胞嘧啶的形成［1］。肿瘤抑制基因CpG岛相关启动子的基因特异性DNA甲基化是众多人类肿瘤标志物［2-3］。多个肿瘤抑制基因的甲基化涉及白血病，淋巴瘤和骨髓瘤的信号通路的失调，由此表明肿瘤抑制基因的甲基化在血液癌症发病机制中的重要性［4-6］。值得注意的是，肿瘤抑制基因DNA甲基化在慢性淋巴细胞性白血病的发病或预后中发挥作用［7］。慢性淋巴细胞白血病是欧美成人最常见的白血病类型，我国较少见，为主要源于B淋巴细胞的单克隆性小淋巴细胞疾病［8］。在本实验中，采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）技术研究了miR-9-3的甲基化，旨在确定其在慢性淋巴细胞性白血病的致病作用。
1材料与方法
1.1研究对象
慢性淋巴细胞性白血病共78 例，均来自内蒙古牙克石市人民医院。男51例（65.4％），女27例（34.6％），年龄37~91岁，平均年龄65.0岁，经诊断符合白血病FAB国际诊断标准。所有病例均为新诊断且未接受过放化疗、诱导分化及骨髓移植等特殊治疗。采集肝素抗凝骨髓1~2 ml/份，收集骨髓单个核细胞，于-80℃保存。8例正常供髓者单个核细胞设为对照组（取自健康志愿者外周血B细胞CD19，N=3；取自健康志愿者外周血血浆，N=2；取自健康志愿者骨髓单个核细胞，N=3）。
1.2细胞株培养
人类白血病细胞株CLL-AAT、MEC1、MEC2、I83-E95、WAC3CD5+、HG3和232B4由内蒙古牙克石市人民医院血液病科赠送。细胞分别保存在含有10％胎牛血清的RPMll640营养培养基（含青霉素100 U/ml和链霉素100 ug/ml），置于320%O2、5%CO2、37℃培养箱培养的细胞培养箱培养。每48~72 h用含有0.02%EDTA、0.01%胰蛋白酶的消化液消化后，进行常规传代培养。实验采用对数生长期细胞。
1.3甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）
按照QIAampDNAMini Kit（QIAGEN，Germany）的操作步骤结合DNA/RNA提取仪（QIAcube）输入程序即可快速抽提78例慢性淋巴细胞性白血病患者骨髓标本和7种慢性淋巴细胞性白血病细胞株DNA，同样方法提取8例正常对照提取DNA。每个样品用两组引物，其中一个针对修饰的甲基化DNA（M），另一个是针对修饰的未甲基化DNA（U）。重亚硫酸氢盐处理：加入新鲜配制的20 mmol /L氢醌12.6 ul和4.8 mol/L亚硫酸氢钠（pH=5.0）320 ul，PCR仪上进行下面循环：55 ℃ 15 min，95 ℃30 s，一共20个循环。以EZ DNA Methylation kit对基因组DNA进行修饰。修饰后的DNA溶解于20 ul的M-Elution Buffer，反应产物在20g/L的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察结果。
1.4MSP测序
首先应用亚硫酸钠对DNA 进行化学修饰，并用作模板，MSP检测miR-9-3基因启动子区DNA序列。将DNA中所有未甲基化的胞嘧啶（C）转化成为胸嘧啶（T），但有甲基化修饰的C经亚硫酸钠处理后仍保持为C。该步骤应用EpiTect Bisulfite Kit（QIAGEN，Germany），按照说明书完成。使用PSQ检测设计软件设计引物。正向引物：5′-GAAGGGGGTTGGGATTTGA-3′；反向引物：5′-ATTTCTCCCCTACTCCCC-3′。
1.55-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-AzaDc）处理
取细胞在对数生长期的I83-E95和WAC3CD5+细胞株，按照1×106个细胞/ml的密度接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，5%CO2、37℃的条件下培养。用终浓度为0.5 uM的5-AzaDc处理，每24 h更换新鲜的5-AzadC，在第0天和第5天分别收获细胞。
1.6Western blot 检测NF-κB1
I83-E9548细胞株转染48 h后收集细胞。加入RIPA裂解液（50 mM的Tris-HCl，pH=7.4，150 mM氯化钠，0.2％SDS，1％TritonX-100，2 mM EDTA），Bradford法测定蛋白浓度，取20 ug蛋白，进行10%SDS-PAGE电泳。电泳完毕后，PAGE胶上的蛋白用Bio-Rad微型电转移至0.2 um的硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜加入NF-κB1，4℃下孵育24 h，然后将膜洗涤，加入抗兔辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗，室温下反应1 h洗膜，曝光，X-胶片经显影、定影后扫描记录。以Anti-actin为内对照。
2结果
2.1慢性淋巴细胞性白血病miR-9-3的MSP 结果
78例慢性淋巴细胞性白血病患者中65例miR-9-3甲基化，MSP阳性率为83%（见图1）；所有8例正常对照组（N1至N8）miR-9-3全部呈未甲基化状态（见图2）；7种慢性淋巴细胞性白血病细胞株miR-9-3甲基化表达谱显示：I83-E95和WAC3CD5+细胞株显示miR-9-3完全甲基化，232B4，CLL-AAT和HG3部分甲基化，而MEC1和MEC2完全未甲基化（见图3）。miR-9-3MSP产物序列分析显示，与miR-9-3原序列相比，除了甲基化的C外，所有的C均被转化为T，而CpG 位点中被甲基化的C未被转化。说明我们的转化方案不仅是高效的，也是特异的（见图4）。
2.25-AzaDc 对miR-9-3甲基化程度的影响
结果表明，处理前I83-E95和WAC3CD5+细胞株miR
-9-3呈甲基化状态，而用5-AzaDc处理后，I83-E95和WAC3CD5+细胞株miR-9-3呈未甲基化状态。
2.3转染miR-9-3对I83-E9548细胞株NF-κB1蛋白水平的影响
I83-E9548细胞株转染48h后收集细胞，提取细泡的蛋白，采用用Western blot法来比较各组细胞内NF-κB1蛋白P105和P50的含量。转染miR-9-3后NF-κB1蛋白P105/50表达水平降低。如图6所示，miR-9-3组与对照组相比NF-κB1蛋白水平降低。
3讨论
成熟的microRNA（miRNA）是一类长度约21-25nt的真核生物内源性非编码单链RNA分子，它在细胞内通过碱基互补与相应的信使RNA（mRNA）的3’-非编码区（3’-URT）结合，使其降解或抑制其翻译，在细胞的分化、增生、凋亡、个体发育及机体代谢中起着重要作用［9］，其功能是抑制其靶蛋白的表达［10］。在癌变过程中，miRNA可分为致癌基因和抑癌基因的miRNA［9］。最近研究表明，癌症患者抑癌基因的miRNA异常DNA甲基化沉默。以往的研究还确定一些抑癌基因的miRNA甲基化参与慢性淋巴细胞性白血病发病，其中包括了miR-203，miR-124-1，miR-181a/b，miR-107和miR-424［10］。
在人类中，有三个独立的miR-9基因（miR-9-1位于1号染色体上；miR-9-2位于5号染色体上；miR-9-3也位于5号染色体上）具有相同的miR-9序列。miR-9即可以是致癌基因的miRNA也可以是抑癌基因的miRNA，取决于癌症或组织类型［11］。例如，miR-9过表达已被证明能提高乳腺癌细胞或胶质母细胞瘤转移或侵袭，表现为致癌作用，反之，miR-9通过结合于3′非翻译区（3′非编码区）的NF-κB1的mRNA，抑制NFκB1翻译卵巢肿瘤细胞，从而抑制细胞增殖，因此表现出肿瘤抑制功能。本实验主要研究miR-9独立基因之一miR-9-3的甲基化。
本实验发现，在I83-E95细胞株miR-9-3完全甲基化导致细胞增殖减少并且增强凋亡。
I83-E95和WAC3CD5+细胞株处理前二者均呈高甲基化状态，而5-AzadC处理后都发生脱甲基化，呈未甲基化状态。这些都说明5-AzaDc具有诱导miR-9-3去甲基化的能力，这种能力可能与5-AzaD降低了miR-9-3表达有关。有人认为5-AzaDc作用机制是先与靶基因结合，再与DNA 甲基转移酶结合，形成一个不可逆的复合体，从而阻断甲基转移酶的活性。
有研究表明［12］，miR-9-3可以通过调控NF-κB1蛋白抑制慢性淋巴细胞性白血病细胞的生长，miR-9-3在慢性淋巴细胞性白血病细胞中是低表达的，而增加miR-9-3可以抑制细胞的体外生长，另外miR-9-3直接作用于NF-κB1的3’UTR区，说明NF-κB1是慢性淋巴细胞性白血病中miR-9-3的重要的靶点，当miR-9-3高表达时NF-κB1的mRNA和蛋白都被抑制。在慢性淋巴细胞性白血病中是否也存在这种相关，本实验设想通过减弱或抑制miR-9-3的表达，观察其对慢性淋巴细胞性白血病细胞NF-κB1的表达，为下一步慢性淋巴细胞性白血病的基因治疗奠定实验基础。
参考文献
［1］ESTELLER M.Epigenetics in cancer［J］.N Engl J Med，2008，358：1148-1159.
［2］CHIM CS， LIANG R， KWONG YL.Hypermethylation of gene promoters in hematological neoplasia［J］. Hematol Oncol，2002， 20：167-176.
［3］JONES PA， BAYLIN SB： The epigenomics of cancer［J］. Cell，2007， 128：683-692.
［4］GONZALEZ-ZULUETA M， BENDER CM， YANG AS， NGUYEN TD， et al. Methylation of the 5′ CpG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing［J］. Cancer Res，1995， 55：4531-4535.
［5］CHIM CS， PANG R， FUNG TK， CHOI CL， LIANG R.Epigenetic dysregulation of Wnt signaling pathway in multiple myeloma［J］. Leukemia，2007，21：2527-2536.
［6］CHIM CS， FUNG TK， WONG KF， LAU J， LIANG R： Frequent DAP kinase but not p14 or Apaf-1 hypermethylation in B-cell chronic lymphocytic leukemia［J］.J Hum Genet，2006， 51：832-838.
［7］RAVAL A， TANNER SM， BYRD JC， ANGERMAN EB，et al. Downregulation of Death-Associated Protein Kinase 1 （DAPK1） in Chronic Lymphocytic Leukemia［J］.Cell，2007， 129：879-890.
［8］姚玉芹，薛重重，杨丽萍. CD40-CD40L 与 B 细胞肿瘤治疗研究进展［J］.现代医院，2013，13（5）：17-19.
［9］黄秀颜，徐新.miRNA与心律失常［J］.现代医院，2013，13（9）：11-131.
［10］CALIN GA， CROCE CM. MicroRNA signatures in human cancers［J］. Nat Rev Cancer，2006， 6：857-866.
［11］CHEN CZ. MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors［J］. N Engl J Med，2005， 353：1768-1771.
［12］WANG LQ， LIANG R， CHIM CS. Methylation of tumor suppressor microRNAs： lessons from lymphoid malignancies［J］. Expert Rev Mol Diagn，2012， 12：755-765.
［13］TSAI KW， LIAO YL， WU CW， HU LY， LI SC， CHAN WC，et al.Aberrant hypermethylation of miR-9 genes in gastric cancer［J］.Epigenetics，2011， 6：1189-1197.
［14］ZHANG H， QI M， LI S， QI T， MEI H，et al.microRNA-9 targets matrix metalloproteinase 14 to inhibit invasion， metastasis， and angiogenesis of neuroblastoma cells［J］. Mol Cancer Ther，2012， 11：1454-1466.