摘 要：目的:探讨多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)患者血清miR-424及miR-520的表达及其临床意义。方法:选取2015年1月至2019年12月我院收治的87例MM患者，依据国际分期系统分为Ⅰ期(n=18)、Ⅱ期(n=26)和Ⅲ期(n=43),根据免疫分型结果分为IgG型(n=49)、IgA型(n=20)、轻链型(n=11)和非分泌型(n=7)。另选取同期60例正常者作为对照组。检测各组血清miR-424、miR-520、胱抑素C(Cys-C)及β2-微球蛋白(β2-MG)水平。应用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平诊断MM的价值。采用Pearson相关分析MM患者血清miR-424、miR-520水平与Cys-C及β2-MG的相关性。结果:MM组血清miR-424(2.93±1.35 vs 0.82±0.27)、miR-520(2.14±0.86 vs 0.56±0.18)、Cys-C(2.16±0.84 vs 0.75±0.18,mg/L)及β2-MG(6.24±2.37 vs 1.80±0.66,mg/L)水平均明显高于对照组(P<0.001)。MM患者Ⅲ期血清miR-424(5.20±2.46 vs 2.28±0.95,1.17±0.38)、miR-520(3.60±1.51 vs 1.87±0.72,0.83±0.26)、Cys-C(3.75±1.28 vs 1.64±0.53,0.90±0.21,mg/L)及β2-MG(8.82±3.14 vs 5.25±1.38,3.12±0.96,mg/L)水平均明显高于Ⅰ期和Ⅱ期(P<0.001),且Ⅱ期血清miR-424(2.28±0.95 vs 1.17±0.38)、miR-520(1.87±0.72 vs 0.83±0.26)、Cys-C(1.64±0.53 vs 0.90±0.21)及β2-MG(5.25±1.38 vs 3.12±0.96)水平均明显高于Ⅰ期(P<0.001)。MM患者IgG型血清miR-424(4.37±2.18 vs 2.40±1.06,2.27±0.93,2.35±0.84)及miR-520(3.22±1.37 vs 1.72±0.74,1.68±0.63,1.78±0.65)水平均明显高于IgA型、轻链型和非分泌型(P<0.001)。ROC曲线分析显示，miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG四项联合诊断MM的曲线下面积(0.963,95%CI:0.910～0.998)最大，其敏感度和特异度为97.0%和92.0%。相关分析结果显示，MM患者血清miR-424及miR-520表达水平与Cys-C及β2-MG均呈正相关(r=0.748,P<0.001,r=0.862,P<0.001,r=0.705,P<0.001,r=0.803,P<0.001)。结论:MM患者血清miR-424及miR-520表达水平明显升高，且随着MM病情分期进展呈升高趋势，联合Cys-C及β2-MG检测对MM诊断具有较高的价值。
关键词：多发性骨髓瘤 miR-424 miR-520 诊断价值
Expression and clinical significance of serum miR-424 and miR-520 in multiple myeloma
HUANG Juanjuan ZHUO Fen XIAO Hua DAI Chengfei SU Haizhou
Department of Hematology,Sanya Central Hospital; Department of Clinical Laboratory,Sanya Central Hospital;
Abstract：Objective:To investigate the expression and clinical significance of miR-424 and miR-520 in patients with multiple myeloma(MM).Methods:The 87 MM patients admitted to our hospital from January 2015 to December 2019 were divided into phase Ⅰ(n=18),phase Ⅱ(n=26)and phase Ⅲ(n=43)according to the international staging system.According to the results of immunotyping, IgG type(n=49),IgA type(n=20),light chain type(n=11)and non secretory type(n=7).Another 60 normal persons in the same period were selected as the control group.The levels of serum miR-424,miR-520, Cystatin C(Cys-C)and β 2-microglobulin(β2-MG)were measured in each group.The diagnostic value of serum miR-424,miR-520,Cys-C and β2-MG in MM were analyzed by ROC curve.Pearson correlation were used to analyze the correlation between serum miR-424 and miR-520 expression levels and Cys-C and β2-MG in MM patients.Results:The levels of serum miR-424(2.93±1.35 vs 0.82±0.27),miR-520(2.14±0.86 vs 0.56±0.18),Cys-C(2.16±0.84 vs 0.75±0.18,mg/L)and β2-MG(6.24±2.37 vs 1.80± 0.66,mg/L)in MM group were significantly higher than those in control group(P<0.001).The levels of serum miR-424(5.20±2.46 vs 2.28±0.95,1.17±0.38),miR-520(3.60±1.51 vs 1.87±0.72,0.83±0.26),Cys-C(3.75±1.28 vs 1.64±0.53,0.90±0.21,mg/L) and β2-MG(8.82±3.14 vs 5.25±1.38,3.12±0.96,mg/L)in MM patients at stage Ⅲ were significantly higher than those at stage Ⅰ and Ⅱ(P<0.001).The levels of serum miR-424(2.28±0.95 vs 1.17±0.38),miR-520(1.87±0.72 vs 0.83±0.26),Cys-C(1.64±0.53 vs 0.90±0.21)and β2-MG(5.25±1.38 vs 3.12±0.96) in phase Ⅱ were significantly higher than those in phase Ⅰ(P<0.001). The levels of serum miR-424(4.37±2.18 vs 2.40±1.06,2.27±0.93,2.35±0.84)and miR-520(3.22±1.37 vs 1.72±0.74,1.68±0.63,1.78±0.65)in MM patients at IgG type were significantly higher than those of IgA,light chain and non secretory types(P<0.001).ROC curve analysis showed that the area under the curve(0.963,95%CI:0.910～0.998)of miR-424,miR-520,Cys-C and β2-MG combined diagnosis MM was the largest, and its sensitivity and specificity were 97.0% and 92.0%.The results of correlation analysis showed that the levels of miR-424 and miR-520 were positively correlated with Cys-C and β2-MG( r = 0. 748,P < 0. 001,r = 0. 862,P < 0. 001,r = 0. 705,P < 0. 001,r = 0. 803,P < 0. 001). Conclusion: The expression levels of serum miR-424 and miR-520 in MM patients were significantly increased,and increased with the progress of MM stage,they combined with Cys-C and β2-MG has a high value in the diagnosis of MM.
Keyword：multiple myeloma; miR-424; miR-520; diagnostic value;
多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种B淋巴细胞介导的恶性浆细胞疾病，其特征为骨髓中浆细胞异常增生，可引起骨痛、骨损伤、贫血、肾脏病 变及细菌性感染等，严重影 响患者的生活质量[1]。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是真核生物中发现的一类内源性具有调控功能的非编码RNA,参与细胞增殖、凋亡、细胞分化、发育和免疫反应等多种生物学过程，可能在MM的发病过程中发挥重要作用[2-3]。有研究表明，miR-424及miR-520能调控多种靶基因的生物学功能，其特异的表达失调与MM的发生、发展密切相关，有望成为MM诊断和治疗的新靶点[4]。然而，目前关于miR-424及miR-520对MM诊断的价值及其能否作为MM诊断的生物标志物尚未明确。为此，本研究通过检测MM患者血清miR-424及miR-520表达水平，分析其与MM分期的关系及诊断MM的价值，旨在为MM的诊疗提供参考依据。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2015年1月1日至2019年12月31日我院收治的87 例MM患者，其中男性 55例，女性32例，年龄43～82(61.50±11.40)岁。依据MM的国际分期系统(international staging system, ISS)[5]标准分为：Ⅰ期18例、Ⅱ期26例、Ⅲ期43例。免疫分型：免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)G型49例、 IgA型20例、轻链型11例、非分泌 型7例。纳入标准：①MM的诊断参照《中国多发性骨髓瘤诊治指南》[6];②初诊患者，能配合本次研究。排除标准：①合并严重心肝肾疾病、恶性肿瘤、其他血液系统疾病及自身免疫性疾病者；②孕妇、妊娠期女性。另选取同期60例健康体检正常者(无严重心肝肾疾病、肿瘤、自身免疫及血液系统疾病)作为对照组，其中男性36例、女性24例，年龄45～75(60.35±10.16)岁。各组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经我院伦理委员会通过，并与患者或家属签署知情同意书。
1.2 miR-424及miR-520检测
miR-424引物： 上游：5'-ACGCTATCTCATAGATGATC-3',下游：5'-GAGTAGCTGATGTCATAGCT-3';miR-520引物：上游：5'-GAGTAGCTCGTAGCTACTAG-3',下游：5'-AG ATAGCATGACTGAGTACG-3';内参照U6上游：5'-CTAGC TACGTCAGCATA-3',下游 :5'-ACGATCACGATCTGCAT-3'。所有研究对象均采集空腹静脉血3 mL于未加抗凝剂的离心管中，3 500 r/min, 离心10 min分离血清，于-70 ℃保存。在ABI 7500型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)。反应体系为20 μL:1 μL 引物及探针Mix(20×),10 μL TaqMan通用混合物溶液(2×),1.33 μL反 向转录脱氧核糖核酸， 7.67 μL双蒸馏水。反应条件：95 ℃预变性 10 min; 95 ℃变性15 s, 55～60 ℃退火及延伸30 s, 共40个循环。采用2-△△Ct法计算miR-424及miR-520的相对表达水平。
1.3 Cys-C及β2-MG检测
另采集空腹静脉血3 mL于未加抗凝剂的离心管中，使用AU680型美国贝克曼全自动生化分析仪及配套试剂检测血清胱抑素C(cystatin C,Cys-C)及β2-微球蛋白(β2-microglobulin, β2-MG)水平。
1.4 统计学方法
采用SPSS 20.0统计软件分析，计量资料以(x¯±s)表示，多组间均数的比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；两独立样本均数的比较采用成组t检验。应用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平诊断MM的价值，曲线下面积(area under cure, AUC)比较采用Z检验。相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MM组和对照组血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平比较
MM组血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.001),见表1。
表1 MM组和对照组血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平比较(x¯±s)
2.2 MM患者不同分期血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平比较
MM患者Ⅲ期血清 miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平均明显高于Ⅰ期和Ⅱ期，差异均有统计学意义(P<0.001);且Ⅱ期血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平均明显高于Ⅰ期，差异均 有统计学意义(P<0.001),见表2。
表2 MM患者不同分期血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平比较(x¯±s)
2.3 MM患者不同免疫分型血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平比较
MM患者IgG型血清miR-424及miR-520水平均明显高于IgA型、轻链型和非分泌型，差异均有统计学意义(P<0.001)。MM患者不同免疫分型血清Cys-C及β2-MG水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05),见表3。
表3 MM患者不同免疫分型血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平比较(x¯±s)
2.4 miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG单项及联合诊断MM的价值
miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG诊断MM的最佳截值分别为1.75、1.28、1.40 mg/L、3.82 mg/L,四项联合诊断MM的曲线下面积(0.963,95%CI:0.910～0.998)明显高于单项miR-424(0.866,95%CI:0.807～0.922)、miR-520(0.832,95%CI:0.778～0.892)、Cys-C(0.793,95%CI:0.734～0.851)及β2-MG(0.815,95%CI:0.757～0.874),差异有统计学意 义(Z=5.317、5.728、6.415、5.904,P<0.05),其敏感度和特异度为97.0%和92.0%,见表4和图1。
表4 miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG单项及联合诊断MM的价值
2.5 血清miR-424、miR-520 表达水平与Cys-C及 β2-MG的相关性分析
Pearson相关分析显示，MM患者血清miR-424表达水平与Cys-C(r=0.748,P<0.001)及β2-MG(r=0.862,P<0.001)均 呈正相关，MM患者血 清miR-520表达水平与Cys-C(r=0.705,P<0.001)及β2-MG(r=0.803,P<0.001)均呈正相关，见图2。
3 讨论
MM是一种复杂的恶性血液系统疾病，其主要特征为骨髓中浆细胞异常克隆性增殖，并大量的分泌单克隆免疫球蛋白及其片段，可导致MM患者有不同程度的骨骼、肾脏等组织器官的损伤[7]。MM的发病机制复杂，主要涉及到骨髓微环境、遗传学上的基因突变、DNA甲基化和组蛋白修饰等调控方式。近年来的研究表明，miRNA作为一类高度保守的内源性单链非编码调控RNA分子，参与细胞增殖、细胞周期、胚胎发育、免疫等多种机体的生理和病理进程，在MM的发病过程中起到重要的作用，并可能作为MM患者基因治疗的新策略[8-9]。有研究指出，MM患者细胞系和血浆中miRNA显著升高，miRNA在MM细胞中的下调抑制增殖，促进细胞凋亡，其通过直接靶向SOX6在MM进展中起着致癌作用，提示miRNA可能是MM防治的潜在治疗靶点[10]。另有研究认为，miRNA不仅具有显著的肿瘤相关性和组织特异性，还具有良好的稳定性及易于检测等优点，有望成为MM的早期诊断、疗效监测、靶向基因治疗的新型分子生物学标志物[11]。
本研究显示，MM组血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平均明显高于对照组，提示血清miR-424及miR-520水平在MM中异常高表达，其可能通过发挥癌基因的作用来参与MM的发病过程。HANDA等[12]研究显示，MM患者miRNA的表达显著升高，与MM发生机制密切相关，提示其具有促癌的作用，在预测MM预后和开发新疗法中的潜力巨大。本研究中随着MM患者ISS分期的增加，血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平逐渐升高，即Ⅲ期>Ⅱ期>Ⅰ期，提示血清miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG水平升高与MM患者的病情进展有关，可能参与MM的发生发展过程。张蕴玉等[13]研究发现，MM患者血清Cys-C及β2-MG水平显著高于健康人，且随着MM病情分期进展呈升高趋势，是MM患者病理分期诊断的标志物，同时能够为临床治疗提供指导。LIU等[14]研究表明，miRNA的高表达可能会促进MM细胞的增值、转移及耐药，是评估肿瘤细胞增殖及迁移活力的重要辅助指标，为MM的诊断和治疗提供了一个新的潜在分子靶点。此外，本研中MM患者IgG型血清miR-424及miR-520水平均明显高于IgA型、轻链型和非分泌型，提示血清miR-424及miR-520水平在IgG型MM患者中呈高表达，检测miR-424及miR-520水平有助于了解MM患者的免疫分型。本研究ROC曲线显示，miR-424、miR-520、Cys-C及β2-MG诊断MM的最佳截值分别为1.75、1.28、1.40 mg/L、3.82 mg/L,单项指标诊断MM的价值有限，四项联合诊断MM的曲线下面积最大，其敏感度和特异度相对较好。本研究相关分析结果也显示，血清miR-424、miR-520表达水平与Cys-C及β2-MG均呈显著正相关。这说明miR-424及miR-520可能是MM的生物学标志物，联合Cys-C及β2-MG检测有助于提高MM的 诊断价值。吴晓颖等[15]研究 显示，β2-MG水平在MM患者Ⅲ期>Ⅱ期>Ⅰ期>健康对照组，β2-MG水平升高与MM患者疾病进展及预后相关，β2-MG单个指标对MM诊断价值不高，联合生物学指标检测可明显提高诊断MM的准确率。ZHANG等[16]通过比较健康人和MM患者miRNA表达水平，结果显示miRNA对MM诊断的敏感度和特异度较高，是MM诊断的非侵入性生物学指标，具有广阔的应用前景。另有研究指出，miRNA能调控多种靶基因的生物学功能，MM相关的miRNA表达谱及基因调控网络有助于从分子水平深入理解MM发生进展及耐药机制，可能为MM早期诊断、靶向治疗和预后判断提供有利的佐证[17]。
综上所述，MM患者血清miR-424及miR-520表达水平明显升高，且随着MM病情分期进展呈 升高趋势，联合Cys-C及β2-MG检测对MM诊断具有较高的价值，同时也为了解MM的发病机制及靶向治疗提供了新思路。但这些研究仍处于初步探索阶段，今后尚需更多的临床研究来进一步证实miR-424及miR-520在MM中的临床应用价值，使其为临床提供更丰富的MM诊疗体系。
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