摘 要：目的 探讨脑和脊髓动静脉畸形(AVM)在分子水平的表达谱差异。方法 提取人脑(bAVM)、脊髓(sAVM)、对照脑血管、对照脊髓血管全蛋白质，通过TMT标记高通量定量蛋白质组学技术检测各组中蛋白质表达水平。结果 在bAVM、sAVM、对照脑血管、对照脊髓血管样本中，采用蛋白质组学方法共检测到3 102个高可信度蛋白质，在bAVM和sAVM中分别有852个和205个蛋白质的表达水平与其对照组有显著改变。生物信息学分析显示，304个蛋白质仅在bAVM中显著高表达，这些蛋白质主要是线粒体相关蛋白质，主要富集于电子传递链及钙调节通路；97个蛋白质仅在sAVM中显著高表达，主要参与细胞外基质的组成。结论 线粒体功能异常及钙调节失衡可能在bAVM畸形血管的病理生理过程中发挥重要作用，细胞外基质组成及其糖基化异常可能参与sAVM畸形血管的进程。
关键词：脑动静脉畸形 脊髓动静脉畸形 蛋白质组学 线粒体 细胞外基质
Differential protein profiling in brain and spinal arteriovenous malformations
WANG Nai-li MENG Shu QIU Wen-ying WANG Xia
Department of Human Anatomy,Histology and Embryology,Institute of Basic Medical Sciences CAMS,School of Basic Medicine PUMC; Department of Immunology,Institute of Basic Medical Sciences CAMS,School of Basic Medicine PUMC;
Abstract：Objective To explore the differences of protein profiling between brain arteriovenous malformation(bAVM) and spinal AVM(sAVM). Methods Proteins were extracted from bAVM,sAVM,control cerebrovascular and control spinal vessel specimens. The protein level in each group was measured by TMT-labeled quantitative proteomics. Results Totally 3 102 protein samples from bAVM, sAVM,control cerebrovascular and control spinal vessel were examined by high-throughput quantitative proteomics. Among them the expression level of 852 proteins was dramatically changed in bAVM and 205 proteins in sAVM. Bioinformatic analysis showed that 304 proteins were highly expressed only in bAVM, most of them were mitochondria proteins, mainly enriched in electron transport chain and calcium regulation pathways, 97 proteins were specifically highly expressed in sAVM associated with extracellular matrix organization. Conclusions The mitochondrial dysfunction and calcium regulation imbalance may play important roles in the process of bAVM. Disturbed extracellular matrix organization and glycoproteins are potentially involved in sAVM progression.
Keyword：brain arteriovenous malformation; spinal arteriovenous malformation; proteomics; mitochondria; extracellular matrix;
动静脉畸形(arteriovenous malformation, AVM)是一类动静脉血管间异常连接的罕见血管疾病，易破裂出血，是患者致残的重要风险因素。常发生于中枢神经系统，包括脑动静脉畸形(brain AVM,bAVM)和脊髓动静脉畸形(spinal AVM,sAVM)[1]。
对AVM发病机制的研究多集中于bAVM, 如血管形成异常，包括血管生成抑制基因 miR-137和miR-195*表达降低[2]、Sox2(transcription factor SOX-2,转录因子SOX-2)-JMJD5(bifunctional peptidase and arginyl-hydroxylase JMJD5,双功能肽酶和精氨酸羟化酶)作用引起内皮细胞间充质转化(endothelial-mesenchymal transition, End-MT)[3],细胞间通讯异常[4]。在sAVM发现细胞外基质和血管形成相关蛋白质表达量异常[5]。
此外，在bAVM和sAVM中均发现内皮祖细胞的富集[6]、及KRAS(GTPase KRas, GTP酶)/BRAF(serine/threonine-protein kinase B-raf, 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)突变[1]诱导的内皮细胞MAPK-ERK(mitogen-activated protein kinase, 丝裂原活化蛋白激酶)通路激活[7]。尚无报道两种疾病间的分子表达特异性。对比bAVM和sAVM的蛋白质表达差异，对深入研究bAVM和sAVM的分子机制，开发疾病特异性的诊断或治疗方法具有重要指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料：
患者bAVM标本(4例)和sAVM标本(4例)来自于清华长庚医院，对照组脑血管(4例)和脊髓血管(4例)来自于国家发育和功能人脑组织库，对照组捐献者无神经系统和血管系统相关疾病。标本详细信息参见表1。所有标本于-80 ℃保存。本研究已获得中国医学科学院基础医学研究所伦理委员会审核(伦理批准号：2018008)。经患者知情同意。
表1 入组患者基本信息Tabel 1 Patient's information
1.1.2 试剂：
尿素(urea)、二硫苏糖醇和碘乙酰胺来自于GE Healthcare公司；蛋白酶抑制剂cocktail来自于Roche公司；Tandem Mass TagTM(TMT)试剂、PBS、甲酸、乙腈、蛋白marker(Thermo Scientific公司);Trypsin/Lys-C(Promega公司);三乙基碳酸氢铵溶液、羟胺、考马斯亮蓝染液(Sigma-Aldrich公司)。
1.2 方法
1.2.1 组织蛋白的提取：
在冷PBS中去除组织中血污染，去除bAVM标本中黏连的脑组织。标本在液氮中迅速冷冻并研磨成粉，加入冷组织裂解液(8 mol/L urea的PBS溶液，含蛋白酶抑制剂cocktail),4 ℃裂解40 min, 12 000×g离心10 min取上清即为组织蛋白提取液。使用超微量分光光度计(NanoDrop 2000)测定蛋白质浓度。
1.2.2 蛋白质的还原、烷基化和TMT标记：
组内按等质量混合各样本蛋白质，制备混合蛋白液。每组取100 μg上述蛋白液，加入10 mmol/L二硫苏糖醇，37 ℃反应1 h, 然后加入25 mmol/L 碘乙酰胺，室温反应1 h。加入Trypsin/Lys-C 37 ℃反应过夜，将蛋白酶解成肽段。脱盐后，0.2 mol/L三乙基碳酸氢铵溶液溶解肽段，各组加入0.8 mg TMT试剂室温标记1 h: TMT-126标记bAVM,TMT-128标记对照脑血管，TMT-129标记sAVM,TMT-131标记对照脊髓血管。加入羟胺中和游离的TMT分子，混合各组样品后脱盐。
1.2.3 高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)分级和液相色谱质谱联用(liquid chromatograph-mass spectrometry, LC-MS/MS)的检测：
为了提高质谱检测到的蛋白质数量，使用HPLC对肽段进行分组。简要步骤为：多肽溶解于100 μL 1%甲酸溶液中，注入HPLC分离。分离色谱柱为Xbridge BEH300 C18 柱子(4.6 mm×250 mm, Waters),柱温维持45 ℃;流动相为乙腈和水(pH=10),流速为1 mL/min; 紫外吸收波长设为214 nm。每1.5 mL收集为1管，最终合并为12组分，旋蒸去除所有溶剂。
将上述12组分分别溶解于20 μL 1%甲酸溶液中，进行LC-MS/MS (Thermo Q Exactive质谱仪)检测。梯度洗脱条件：C18分析色谱柱(300 Å,75 μm×150 mm),0.30 μL/min, 120 min。质谱检测条件：Q Exactive质谱采取数据依赖性采集模式，Orbitrap(400-1 800 m/z, 60 000分辨率)中行全谱扫描，随后以27%碰撞能量(higher-energy C-trap dissociation, HCD)进行10次数据依赖的MS/MS扫描。
质谱获得的数据使用Proteome Discoverer 2.2软件进行搜库，人源fasta数据库于2020年10月在Uniprot网站下载。
1.2.4 生物信息学分析：
可信蛋白质的筛选条件设置为：unique peptide≥2,FDR≤0.01,差异蛋白质的筛选条件设置为：变化倍数≥2.0或≤0.5。蛋白质组数据分析使用到多个分析平台和软件：悟空云平台(https: //www.omicsolution.org/wkomics/main/)进行PCA、HCA、相关性分析，Funrich软件进行Gene Ontology分析，Cytoscape软件进行ClueGO和蛋白质-蛋白质相互作用分析，网络版WEB-based GEne SeT Analysis Toolkit进行Wikipathway分析，GraphPad Prism辅助作图。
1.2.5 蛋白质表达水平的验证：
通过Western blot验证蛋白质在bAVM、sAVM、对照脑血管和对照脊髓血管中的表达水平。由于蛋白质总量有限，将各组的样本按照等质量混合。使用NanoDrop2000超微量分光光度计测定浓度后，将各组蛋白质进行SDS-PAGE分离，通过考马斯亮蓝染色确定各组上样量。将等质量蛋白通过SDS-PAGE分离，电转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭后，使用1∶1 000稀释的一抗(MMP9,ab137867,Abcam; VDAC,cst-4866,Cell Signaling Technology公司)在4 ℃ 孵育过夜。与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h, 化学发光法检测抗原抗体结合条带。
2 结果
2.1 高通量质谱检测bAVM和sAVM中蛋白质表达谱的异同
在对照脑血管、bAVM血管、对照脊髓血管、sAVM血管中共检测到3 102个高可信度蛋白质。对照组脑血管和脊髓血管的蛋白质表达谱相近，相关性系数为0.98,bAVM畸形血管中蛋白质的表达丰度与其他3组的差异最大(图1)。
图1 对照脑血管和脊髓血管的蛋白质表达谱相近
bAVM畸形血管中蛋白质表达量发生变化的蛋白质数量更多(图2A)。相比于对照组血管，bAVM畸形血管中286个蛋白质的表达量下调，566个蛋白质的表达量上调；sAVM畸形血管中90个蛋白质的表达量下调，115个蛋白质的表达量上调。bAVM和sAVM中表达量变化的蛋白质共941个，其中116个蛋白质在两种畸形血管中的表达量均显著改变(图2B)。在本研究中，将这941个蛋白质定义为全部差异表达蛋白质。
941个差异表达蛋白质的HCA分析结果显示(图2C),这些蛋白质可分为12个cluster, 其中cluster 4中304个蛋白质仅在bAVM血管中显著高表达，cluster 5中97个蛋白质仅在sAVM血管中显著高表达。后续对cluster 4和cluster 5中的蛋白质分别进行分析。
2.2 bAVM畸形血管细胞中线粒体稳态及钙调节失衡
在bAVM中显著高表达的304个差异表达蛋白质主要为线粒体及相关蛋白质，富集于线粒体复合物I、电子传递链、钙调节等信号通路(图3)。
2.3 sAVM中细胞外基质蛋白质及其糖基化异常
图2 b AVM和s AVM中差异表达蛋白质分析
图3 bAVM畸形血管中线粒体稳态及钙调节失衡
sAVM畸形血管中显著高表达的97个蛋白质(cluster 5)主要是以ADAM10(disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10)、MMRN1(multimerin-1)、TNC(tenascin)、VCAN(versican core protein)、KNG1(kininogen-1)、LAMB1(laminin subunit beta-1)为核心的细胞外基质蛋白或糖蛋白(图4)。
2.4 Western blot检测bAVM和sAVM中蛋白质表达水平
线粒体蛋白VDAC(voltage-dependent anion channel)在bAVM中显著高表达，细胞外基质蛋白MMP9(matrix metalloproteinase-9)在sAVM中显著高表达(图5)。
图4 sAVM中细胞外基质蛋白质及其糖基化异常
图5 Western blot检测VDAC和MMP9在bAVM 和sAVM中的表达水平
3 讨论
蛋白质组学技术以蛋白质组为研究对象，可无偏见的、在整体水平探究细胞或组织的蛋白质组成及其动态变化规律。探究bAVM和sAVM的蛋白质组表达，可系统地评估两种疾病的相似和差异，为寻找疾病的特异性分子机制或靶标提供线索。
前期蛋白质组学研究报道，参与细胞间通讯的分子黏附通路蛋白质的表达水平在人bAVM和sAVM畸形血管中均显著改变[4-5]。本文中，作者发现线粒体稳态及钙调节相关蛋白质的表达水平在bAVM中明显改变，细胞外基质蛋白质在sAVM中显著高表达。该结果揭示了bAVM和sAVM特异性的分子特征，为充分理解bAVM和sAVM的分子机制提供参考和补充。
线粒体和内质网是细胞内重要的钙离子储存器，VDAC是线粒体外膜上高表达的钙转运蛋白，通过Grp75(glucose related protein 75)偶联IP3Rs形成大分子转运体，介导线粒体外膜将钙离子从内质网转运至线粒体内[8]。钙离子可直接激活电子传递链和ATP合酶的活性，促进ATP生成[9],调控线粒体能量代谢。在心肌细胞中，抑制线粒体复合物I可引起线粒体能量异常，导致细胞死亡[10]。本文结果显示bAVM中多个线粒体复合物I蛋白的表达水平显著升高，推测线粒体稳态及钙调节失衡在bAVM的病理过程中可能具有重要调节作用。
细胞外基质是存在于细胞间的动态网状结构，由胶原、蛋白聚糖、弹性纤维等大分子物质组成。通过与细胞表面上的受体结合，调控细胞骨架结构，引起细胞内细胞传导，影响细胞的增殖和分化。基质金属蛋白酶ADAM10-Notch通路、细胞外基质糖蛋白TNC-RhoA/ROCK通路可影响内皮细胞间紧密连接参与血管结构稳态调节[11-13]。细胞外基质黏附蛋白MMRN1结合内皮细胞 vWF(von Willebrand factor),稳定血小板黏附[14]。通过ADAMTS5水解VCAN成为versikines, 促进血管内皮细胞的黏附、增殖，促进新生血管形成[15]。在本研究中，作者发现以ADAM10、TNC、VCAN、MMRN1为核心的细胞外基质蛋白及糖蛋白的表达水平在sAVM中过表达，在bAVM中的变化差异无统计学意义。提示细胞外基质组成对sAVM血管结构的稳定具有重要调控作用。
本文仍存在一定的局限性：本文结论是基于小样本量蛋白质组学分析的推测，需在大数量样本上进行验证，并在细胞水平进一步证实该结论。
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