曹翌明 孟繁荣 谢贝 蔡杏珊 黄业伦 牛群 雷杰 高俊文 谭耀驹 刘志辉
基金项目：国家“十二五”传染病防治重大科技专项（编号：2012ZX10004-903）；广东省科技计划项目（编号：2011B31800377）
【摘要】目的 寻找异烟肼耐药结核杆菌特异性分泌蛋白。 方法应用弱阳离子交换蛋白质芯片（WCX2）捕获并应用表面增强激光解析-电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术对1株异烟肼单耐药结核杆菌和1株异烟肼敏感结核杆菌临床分离株7天及14天Middlebrook 7H9 培养滤液蛋白进行比较，描述性分析其差异。 结果 在异烟肼敏感和异烟肼单耐药结核杆菌株7天及14天Middlebrook 7H9 培养滤液中分别检测到164、175、133、147种蛋白质/多肽，其相对分子量（依质荷比m/z而得）范围分别为982～9 328、997～9 327、1 050～8 903、9 96～9 369，表达丰度（通过质谱峰面积计算）分别为17～2 100、21～1 943、60～5 355、41～3 267；异烟肼单耐药结核杆菌株与异烟肼敏感结核杆菌株相比较，7和14天培养滤液分别存在47与58种差异蛋白质/多肽，这些差异蛋白质相对分子量在1 083～8 812、1 012～9 327之间，表达丰度在76～1 811、25～3 010之间。 结论 异烟肼敏感结核杆菌和耐药结核杆菌液体培养早中期滤液蛋白质存在差异，但是否为异烟肼耐药结核杆菌特异性分泌蛋白则有待进一步证实。
【关键词】结核杆菌培养滤液蛋白异烟肼表面增强激光解析-电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）
异烟肼（Isoniazid，INH）具有强大的杀菌作用，可杀灭细胞内外的结核杆菌，在抗结核化疗中系“全效杀菌药”，是当今最为重要的抗结核药物之一。但是异烟肼耐药结核杆菌株的出现与流行［1］目前已成为结核病临床与控制中的重大问题，对异烟肼和利福平同时耐药而致耐多药结核病（Multidrug-Resistant Tuberculosis，MDR-TB）更被视为“白色瘟疫”［2］。其耐药性诊断目前主要依据药物敏感性测定结果，但现行的比例法测定至少需要4 w之久；新近WHO推荐的Xpert MTB/RIF 方法对katG等结核杆菌异烟肼耐药基因检测虽然较为快速，但因技术条件要求较高而难于在基层单位普及推广应用［3］，也因异烟肼耐药机制复杂导致这些耐药基因检测指示结核杆菌异烟肼耐药的敏感性并不理想［4］。因此，准确、快速、经济、简便的结核杆菌耐药性测定新方法的探索一直为人们所关注，新型检测标志物的发现则是其关键。目前不少研究表明异烟肼耐药和敏感结核杆菌蛋白质组存在差异，它们很有可能成为新的诊断和治疗靶蛋白［5-6］。同时受我们前期有关结核杆菌特异性分泌蛋白MPT64检测可以准确、快速检测鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌研究结果［7］的启发，我们推测在异烟肼耐药和敏感结核杆菌间也许可能存在此种差异分泌蛋白而可作为耐药性测定新型标志物。为此我们应用表面增强激光解析-电离飞行时间质谱（Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS）技术对1株异烟肼单耐药结核杆菌和1株异烟肼敏感结核杆菌临床分离株7天及14天Middlebrook 7H9 培养滤液蛋白进行了初步分析和比较，现报告如下。
1材料与方法
1.1分析菌株
在本院所建广东地区分枝杆菌菌株库中采用随机数字表法随机抽取对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇4种药物全部敏感或仅对异烟肼耐药的结核杆菌临床分离株各1株。
1.2主要仪器与试剂
1.2.1主要仪器应用Bruker Autoflex 2.0质谱仪分析弱阳离子交换蛋白质芯片（WCX2）磁珠捕获的培养滤液蛋白质。
1.2.2主要试剂购买BD公司Middlebrook 7H9培养基琼脂粉、OADC促生长剂自行配制分枝杆菌Middlebrook 7H9液体培养基；应用布鲁克公司弱阳离子交换蛋白质芯片（WCX2）磁珠捕获培养滤液蛋白组份。
1.3实验方法
1.3.1结核杆菌培养按试剂说明书配制Middlebrook 7H9液体培养基(约8 毫升/支)，将复苏后菌株分别接种于4支培养基（每支培养基接种冻存液约0?1 ml），37 ℃温箱孵育。
1.3.2培养滤液制备在培养第7天、第14天分别对每株各2支培养液用0.22 μm滤纸过滤，制备约2 ml滤液分装于3支洁净冻存管，-80 ℃冻存备用。
1.3.3生物质谱用蛋白质分析样品制备主要包括磁珠捕获目的蛋白、磁珠结合蛋白分离与纯化、磁珠与目的蛋白分离等步骤：①将磁珠结合缓冲液10 μl、WCX2磁珠10 μl、培养滤液5 μl加至200 μl样品管混匀，室温静置5 min，WCX2磁珠捕获目的蛋白；②在磁株分离器中使磁珠贴壁，使其与悬浮液体分离；③移除悬浮液，加100 μl磁珠清洗缓冲液，置磁珠分离器中1 min，使磁珠贴壁，移除悬浮液，重复操作2次，彻底清除磁珠表面粘附的非目标分析物；④加5 μl磁珠洗脱缓冲液，置于磁珠分离器中2 min，使磁珠贴壁，使其与悬浮液充分分离；⑤移取悬浮上清液于约0?5 ml的样品管，并加入相应的稳定缓冲液，即得质谱分析样品。具体实验操作见试剂说明书。
1.3.4蛋白质样品生物质谱分析按仪器操作程序清洁Anchorchip靶与调整质谱仪参数；将1 μl标准品、分析样品与10 μl基质液混匀，取1 μl点于600 μm Anchorchip靶的样品位上，室温干燥几分钟后放入质谱仪进行检测分析；利用ClinProTools分析软件进行数据采集与处理。
1.4统计学分析
以质荷比（m/z）而得的相对分子量判断蛋白质/多肽种类，由用质谱峰面积计算而得的相对强度表示培养滤液蛋白质丰度，描述性分析与比较培养滤液差异蛋白质的种类、相对分子量范围和表达丰度水平。
2结果
2.1异烟肼敏感和异烟肼单耐药结核杆菌株7天及14天Middlebrook 7H9 培养滤液蛋白质生物质谱分析结果
在异烟肼敏感和异烟肼单耐药结核杆菌株7天及14天Middlebrook 7H9 培养滤液中分别检测到164、175、133、147种蛋白质/多肽，具体情况见表1。
2.2异烟肼敏感和异烟肼单耐药结核杆菌株7天及14天Middlebrook 7H9 培养滤液差异蛋白质
异烟肼单耐药结核杆菌株与异烟肼敏感结核杆菌株相比较，7和14天培养滤液分别存在47与58种差异蛋白质/多肽，这些差异蛋白质相对分子量在1 083～8 812、1 012～9 327之间，表达丰度在76～1 811、25～3 010之间。
3讨论
新近研究表明分枝杆菌能通过其特有的分泌系统分泌多种生物活性蛋白质而参与病原体和宿主的相互作用［8］，在异烟肼敏感和异烟肼单耐药结核杆菌株7天及14天Middlebrook 7H9 培养滤液中分别检测到164、175、133、147种蛋白质/多肽，即表明结核杆菌在培养的早期开始即有活跃的蛋白质代谢与分泌活动。异烟肼敏感和异烟肼单耐药结核杆菌是否可能通过改变其蛋白质分泌活动而表现其生物学行为，目前不得而知。我们所得到的异烟肼单耐药结核杆菌株与异烟肼敏感结核杆菌株7和14天培养滤液分别存在47与58种差异蛋白质/多肽的实验结果则提示了此种可能性。从这些差异蛋白质的相对分子量和表达丰度来看，它们均为低丰度小分子量蛋白质，符合细菌分泌蛋白质的表观特征。
但是我们应用的Middlebrook 7H9 液体培养基含有牛血清白蛋白Ⅴ、触酶等蛋白质成份，和张为民等［9］的研究结果类似，在Middlebrook 7H9液体培养基中检测到近100种蛋白质／多肽，可以肯定的是：我们在异烟肼单耐药结核杆菌株与异烟肼敏感结核杆菌株7和14天培养滤液中检测到的蛋白质相当部分来自细菌生命活动对培养基蛋白质成份进行的代谢。而且我们通过对不同结核杆菌菌株的Middlebrook 7H9 培养滤液蛋白质进行分析得到如下结果：在体外液体培养条件下，不同结核杆菌菌株间的蛋白质代谢和分泌活动存在较大差异［10］。继之而来的问题是：我们检测到的异烟肼单耐药结核杆菌株与异烟肼敏感结核杆菌株7和14天培养滤液中存在的差异蛋白哪些来自细菌对培养基蛋白成份的代谢活动、哪些来自细菌的个体差异、又有哪些的确缘自异烟肼结核杆菌所特有的蛋白质分泌活动？使用无蛋白质成份的培养基进行多菌株间的分析比较有望能够揭示这些问题，我们目前正在进行这方面的工作。
参考文献
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