韦 毅 支成斌 孙桂兰 匡中国
贵州省兴义市人民医院感染性疾病科，贵州兴义 562400
[摘要] 目的 了解实时动态荧光定量PCR（FQ-PCR）监测在肺结核诊断中的临床价值。方法 采用前瞻性的方法用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术对继发性肺结核患者的痰和结核性胸膜炎患者的胸水作DNA(TB-DNA)定量监测，同时对非肺结核患者的痰作DNA(TB-DNA)定量监测。结果 继发型肺结核147例，痰涂片阳性率为21.09%，痰TB-DNA阳性例次率为36.73%；痰涂片抗酸染色阳性例次率为15.04%；在痰涂片TB阳性34例次中，痰菌TB-DNA阳性例次率为23.53%。在痰涂TB阴性的192例次中，TB-DNA阳性例次率为39.06%。结核性膜炎胸水检查TB-DNA108例次，阳性例次率为12.03%；非肺结核患者112例。假阴性率为 70.21%，假阳性率为 9.60 %，灵敏度为 29.8 %，特异度为 90.3 %。结论 荧光定量PCR(FQ-PCR)TB-DNA监测结果与国内报到不一致，其假阴性高，假阳性亦高，灵敏度低，特异度亦不高，且痰涂片抗酸杆菌阳性病人的痰TB-DNA阳性例次率亦低，对临床诊断帮助不大，不作为疑似肺结核病人的常规检查。
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关键词 ] 时动态荧光定量；肺结核；灵敏度；特异度
[中图分类号] R521 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）10（a）-0156-02
[作者简介] 韦毅 （1973-），男，汉族，贵州省兴义市人，硕士，副主任医师，主要从事传染病诊疗工作。
肺结核发病率呈逐年递增趋势，由于抗菌药物的不合理使用及不规则治疗，使结核杆菌产生耐药菌株而致多重耐药或耐多药结核菌产生，给临床治愈肺结核带来了极大困难。痰涂片抗酸染色查到结核抗酸杆菌和痰结核菌培养出结核分枝杆菌是临床确诊肺结核并与其他肺部疾病鉴别的重要依据。近年来作为直接检测分支杆菌、种系鉴定和药敏试验的许多分子学方法得到了长足发展，大大提高了结核的检出率，其中，实时动态荧光定量PCR（FQ-PCR）因其技术成熟具有较高的灵敏度和特异性，已逐渐应用于临床，为了解其在肺结核诊断中的临床价值，对2012年3月—2013年12月之间在我院住院的肺结核病人和非肺结核病人进行痰或胸水PCR（FQ-PCR）检测TB-DNA结果与传统的痰涂片或胸水涂片查抗酸杆菌的方法进行比较，现报道如下。
1资料与方法
1.1 一般资料
采用前瞻性的方法用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测肺结核患者238例，其中男性155例， 女性83例，年龄10~82岁，诊断为继发型肺结核147例，结核性胸膜炎91例。送检痰标本147例，胸水91例。非肺结核患者112例。痰标本作结核分枝杆菌DNA(TB-DNA)定量，同时进行痰抗酸染色检查；胸水作结核分枝杆菌DNA(TB-DNA)定量，同时进行胸水抗酸染色检查。对非肺结核患者的痰液作结核分枝杆菌DNA(TB-DNA)定量作对照，以临床诊断结果为金标准,分别计算TB-DNA、抗酸染色检查的灵敏度、特异性和准确度，对两组结果进行比较，以了解其在临床诊断中的价值。
1.2 材料与试剂
检测仪器为广州达安DA-7600型检测系统。试剂亦为广州达安生产的结核分枝杆菌核酸检验试剂盒（PCR—荧光法）。
1.3检验方法
1.3.1 DNA提取（1）阴性质控品处理。提取阴性质控品，8，000rpm离心数秒，吸50~0.5mL灭菌离心管中，加入50uL DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）min；12，000rpm离心5 min，备用。
（2）痰或胸水处理。①向玻璃管中加入4倍体积的4%NaOH，摇匀，室温放置15～30 min待液化；②取液化后标本1.0~1.5 mL离心管，12，000rpm离心5 min；③去上清，沉淀加灭菌生理盐水1 mL混匀，12，000 min离心5 min，如此两次。去上清，沉淀加入50 uL DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）min；12，000rpm离心5 min，备用。
1.3.2 PCR扩增PE GeneAmp5700操作。
（1）试剂准备：按比例（TB—PCR反应液40 uL/人份+Taq酶/人份）取相应的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43 uL/管分装至0.2mL离心管中，备用。
（2）加样：向准备好试剂的0.2 mL离心管中，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2 uL，或直接加入阳性定量参考品2 uL，8，000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑。①按对应顺序设置阴性质控品、阳性定量参考品以及未知标本（含临界阳性质控品和强阳性质控品），并在name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，点击工具栏中P键，选择Prl Primerl后关闭窗口。②打开instrument窗口设置循环条件：93℃ 2 min，然后按93℃ 45s→55℃ 60s→10个循环，再93℃ 30s→55℃ 45s→30个循环。保存文件，运行。
（4）结果分析。①反应结束后保存检测数据文件。②分析条件设置：根据分析图像调节Baseline的start值、stop值以及Threshold的Valve值。使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于-1.0～-0.97。在Analyze自动分析结果。③到Tray窗口记录未知标本数值（C）。“C”表示样品的浓度和含量。
1.3.3 质量控制阴性质控品：增长的曲线不呈S型曲线或Ct值=30；阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在1×106基因拷贝/mL～2.0×107基因拷贝/mL范围，临界阳性质控品定量参考值在2×102基因拷贝/mL～2.0×104基因拷贝/mL范围；以上要示需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需从新进行。
1.4统计分析
采用EXCEL 2003软件进行统计分析，计数资料以率表示。
2结果
继发型肺结核147例，31例痰涂片抗酸染色找结核分枝杆菌阳性。痰涂片阳性率为21.09%，继发型肺结核痰TB-DNA检查例次226例次，TB-DNA阳性83例次，阳性例次率为36.73%；痰涂片TB阳性34例次，痰涂片抗酸染色阳性例次率为15.04%；在痰涂片TB阳性34例次中TB-DNA检查阳性例次为8例次，痰菌阳性TB-DNA阳性例次率为23.53%。在痰涂TB阴性的192例次中，TB-DNA阳性例次为75例次，TB-DNA阳性例次率为39.06%。结核性膜炎胸水检查TB-DNA108例次，阳性13例次，阴性95例次，阳性例次率为12.03%。非肺结核患者112例，查痰TB-DNA 124 例次，TB-DNA阳性 12例次，假阴性率为 70.21%，假阳性率为 9.60 %。灵敏度为 29.8 %，特异度为 90.3 %。具体见表1和表2。
3讨论
痰涂片抗酸染色查到结核抗酸杆菌和痰结核菌培养出结核抗酸杆菌仍是确诊肺结核的重要依据，痰涂片抗酸染色法简单、快速、经济，但敏感性差，不能将结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌区别开来，其诊断的特异性低。随着分子生学的快速发展，荧光PCR（FQ-PCR）技术把核酸扩增、杂交和光谱技术结合在一起，在封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而出现假阳性，利用特异性探针，实时检测，与自动分析一体化，实现了精确、特异、简便、快速的检测。我院肺结核147例肺结核痰涂片阳性检出率为21.09%，痰菌荧光定量PCR法的阳性检出例次率为36.73%，痰菌荧光定量PCR法的阳性检出例次率明显高于痰涂片抗酸染色阳性例次率（抗酸染色阳性例次率为15.04%），肺结核痰涂片阳性检出率与国内痰涂片21.0%报道值相近，但本研究的PCR法检测阳性率低于国内64.0%~90%的报道的报道[1-3]。
我院结核性胸膜炎胸水荧光定量PCR法的阳性检出例次率为12.03%。明显低于应用PCR技术检测胸水中的TB-DNA，敏感性为38.5%的报道，主要是出现假阴性所致，出现假阴性的原因是DNA聚合酶活力不够，或因有酚、氯仿等物存在而使其活性受到抑制等因素影响PCR循环扩增效率，减少特异性DNA扩增产量。有学者报道约5%的标本组中测到抑制物的存在，据认为是DNA聚合酶的抵制物[4]。
肺结核是由结核分枝杆菌感染而引起的慢性呼吸系统传染病，根据WHO统计，目前全世界共有2000万肺结核病人，其中95%在发展中国家，而我国排列世界第二，仅活动性肺结核病人就有近500万。实时荧光定量聚合酶链反应技术因其快速简便，灵敏度高，特异性高等优点，已经成为结核病实验室诊断的重要辅助手段[5]。本研究肺结核患者痰菌阳性病人TB-DNA阳性例次率为23.53%。非肺结核患者出现6例痰荧光定量PCR法TB-DNA出现假阳性，假阳性例次率为9.60 %，分析其原因考虑为在标本预处理和DNA纯化过程操作不当造成的标本污染所致的假阳性[6]。我院肺结核患者TB-DNA假阴性率为 70.21%，灵敏度为 29.8%，特异度为 90.3%，故假阴性高，假阳性亦高，灵敏度低，特异度亦不高，且痰涂片抗酸杆菌阳性病人的痰TB-DNA阳性例次率仅为23.53%，故痰或胸水TB-DNA检验结果阳性不能肯定肺结核，阴性亦不能排除肺结核，虽痰TB-DNA阳性率高于痰涂片阳性率，但临床诊断价值不大，故痰或胸水荧光定量PCR法查TB-DNA不作为疑似肺结核病人的常规检查。
[参与文献]
[1]吴国兰，陈晓红，李学玲，等，4种不同支气管肺泡灌洗液结核杆菌检测方法在肺结核诊断中的应用研究[J].中国临床医生，2013，41（3）39-41.
[2]牛海军，张信鸽，赵长生，等.实时定量PCR技术在肺结核诊断中的价值[J].ATD 医药论坛杂志，2013，34（9）：132-133.
[3]孙集思，陈亦洋.PCR法检测痰液结核杆菌对诊断价值的研究[J].中国社区医师，2012，14（2）：266.
[4]徐伟，张小润，高林虎.PCR诊断结核性炎的临床评价[J].中国煤炭工业医学杂志，2010，13（7）：1045-1046.
[5]牛海军，张信鸽，赵长生，等.实时定量PCR技术在肺结核诊断中的价值[J].医药论坛杂志，2013，34（9）：132-133.
[6]李锐成，刘昕阳，邹菊贤，等，3860例不同标本结核分枝杆菌DNA检测结果分析[J].中国卫生检验杂志，2013，23（8）：1987-1989.
（收稿日期：2014-08-05）