孙丽娜1 孙京涛2 田永全3
1.廊坊市疾病预防控制中心 ，河北廊坊 065000；2.廊坊市人民医院，河北廊坊 065000；3.廊坊市食品工程学校，河北廊坊 065000
摘要]目的 通过评价HSP65抗原表达在结核病血清诊断中的效果，分析其应用前景。方法 取活动期结核病患者63例纳入观察组，选取体检健康志愿者60例纳入对照组，就HSP65分别与38kDa、16kDa、LAM联合检测诊断对照组与观察组结核病。结果 Western-blot结果显示，表达产物在相对分子量65kμ处有一条表达带，在健康人血清阴性中则无表达带；特异度、敏感度与38kPa基本一致，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 HSP65在结核病血清诊断中可作为备选标志物，反应强度与38kDa基本相当，联合诊断有助于提高诊断符合率；HSP65对结核病X线空洞影敏感度较高。
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关键词 ]结核病；结核分歧杆菌；血清学；HSP65
[中图分类号]R69[文献标识码]A[文章编号]1674-0742（2015）04（a）-0010-002
[作者简介]孙丽娜（1978.7-），河北廊坊人，本科，主管技师，研究方向：检验。
结核病（tuberculosis，TB）是一种结核分枝杆菌感染引起的传染病，全世界每年约有20亿人感染结核分枝杆菌（M.tuberculosis，MTB），我国TB发生率、发病率、病死例均位于世界前列，TB防控形势仍不容乐观[1-2]。MTB潜伏性是致TB防控效果不佳的主要原因之一，感染者早期常无典型症状表现，且难以根除，无症状携带者对MTB抗原产生迟发型超敏反应（DTH）是潜伏期诊断的唯一指标。
1 资料与方法
1.1 一般资料
以2013年2月—2014年5月该医院收治的所有活动期结核患者作为研究对象。纳入标准：①临床确诊，活动期患者；②知情同意；③临床资料完整。入选患者63例纳入观察组，其中男33例、女30例，年龄27～64岁，平均（44±14）岁，病程1～8年，平均（1.5±3.2）年，抗酸染色阳性43例、痰细菌培养阳性52例、PPD皮试阳性35例，X线片结核空洞影46例。选取体检健康志愿者60例纳入对照组，其中男31例、女29例，年龄28～64岁，平均（45±12）岁，未合并有肺部疾病，如肺结核、肺炎，两组患者年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2 材料与试剂
E.coli DH5α、MTB H37Rv株，pPRO EX HTa原核表达载体，GCG疫苗株，Takara公司提供。LA Taq DNA聚合酶、Ecor I试剂Takara公司提供，T4连接酶、质粒DNA小量提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司产），DNA快速纯化/回收试剂盒，标准蛋白分子量、HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗人IgG，鼠抗MTB HSP65 mAb等。仪器主要包括：TGL.16G高速台式离心机，HERAEYS CO2培养箱，法VILBER LOURMAT公司产VILBER凝胶成像仪，SPECORD 40紫外分光光度仪，-70℃超低温冰箱，倒置显微镜，生物安全台，医用净化工作台，Dy-3D 型多功能电泳仪，紧密电子天平，Olymbus公司荧光显微镜，SUN公司酶联免疫吸附仪等。
1.3 方法
制备E.coli DH 5α感受态细胞。参照GenBank组织标准MTB HSP65编码，设计引物，由北京奥科生物技术有限公司提供。扩增HSP65基因，扩增产物行DNA快速纯化回收。回收产物与克隆载体，将混合物以热休克法转化为E.coli DH5α感受态细胞，观察白色菌落。进行重组质离酶切鉴定、序列测定，阳性克隆名为pPRO-hsp65，进行鉴定，取鉴定正确的阳性菌行IPTG诱导，诱导后行SDS-PAGE凝胶电泳分析。以Ni-NTA纯化试剂盒纯化蛋白，离心100 mL诱导菌液，制备样品，进行亲和色谱纯化，收集洗脱液，以紫外分光光度仪测定纯化蛋白浓度，将洗脱液以置于-20℃恒温冰箱保存备用。
表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析后，100V恒压电转1h行蛋白电转，后转至硝酸纤维素膜上、行丽春红染色，若蛋白电转成功，以蒸馏水洗至褪色，以10g/L牛血清白蛋白TBST封闭30min，连续震荡洗涤3×5min，分别以鼠抗MTB HSP 65mAb、观察组患者血清、对照组健康人血清结合1h，TBST震荡洗涤3×5min，加HRP标记羊抗鼠IgG结合1h，TBST震荡洗涤3×5min，以OPD显色液观察结果。同时，联合目前临床已相对成熟的38kDa、16kDa、LAM抗原血清学应答辅助诊断，将观察组与对照组患者血清编号打乱，观察组作为“真阳性”、对照组为“假阳性”，则敏感度=观察组中检查出的阳性例数/真阳性例，特异度=观察组中检查出阴性例数/真阴性例。
1.4 统计方法
数据以SPSS13.0软件处理，计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用c2检验，。
2 结果
2.1 不同抗原表达血清诊断
Western-blot结果显示，表达产物在相对分子量65kμ处有一条表达带。HSP65分别与38kDa、16kDa、LAM联合检测，敏感度、特异度均有不同程度提高，其中与38kDa联合检测敏感度、特异度最高，HSP65＋38kDa敏感度高于HSP65，HSP65特异度高于16kDa，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1
2.2 抗酸染色、PPD皮试与X线片对HSP65检测影响
HSP65血清抗原检测正确者X线片结核空洞影比重高于错误者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。
3 讨论
该次实验以Ppro EX HTa表达为载体，行酶切位，高效转录Trc启动子，以表达HSP65基因，有利于蛋白的分离纯化，且表达较稳定，蛋白生物学活性保留较好[4-5]。分离纯化HSP65，行血清学检测结果，显示敏感度达68.75%、特异度达86.67%，高于LAM、16kDa，与38kDa基本持平，后三者均为目前临床常用的MTB感染血清学诊断标志物，提示HSP65可作为血清学诊断TB单独标志物。此外，HSP65＋38kDa敏感度高于HSP65，HSP65特异度高于16kDa，差异有统计学意义（P＜0.05），提示联合检测可能提高检测敏感度，但无法有效提高特异度。关于LAM、16kDa、38kDa血清学诊断肺结核研究较少，敏感度在40%～90%之间，如林楠等以4种结核抗原进行结核病血清学诊断，单独应用灵敏度在30.9%～66%，特异度76.2%～90.5%[2-3，6]，不同学者研究结果存在较大差异，这与不同患者肺结核严重程度、结核分枝杆菌活动度存在较大差异纳入患者标准不统一有关，血清学检测运用于结核病诊断敏感度仍较低，大规模推广尚需时日。
该次研究表明，HSP65诊断正确者抗酸染色阳性比重、PPD皮试阳性比重差异无统计学意义（P＞0.05），提示抗酸染色阳性比重、PPD皮试阳性不能真实反映MTB应激状态。HSP65血清抗原检测正确者X线片结核空洞影比重高于错误者，差异有统计学意义（P＜0.05），提示X线片空洞形成与MTB应激有关，提示患者病情已进入或将要进入活动期。刘志辉等对结核性胸膜炎患者结核分枝杆菌培养滤液、胸腔积液和血清蛋白质组进行分析，结果显示滤液、胸液与血清特异性蛋白质标志物密切相关，而滤液、胸腔积液与空洞形成有关[7]。目前，已有血清学快速诊断肺结核技术，孟炜丽等以血清腺苷脱氨酶诊断肺结核敏感度达94.0%、特异性70.7%，具有较高的应用价值，HSP65在结核病血清诊断中的应用仍有待时日[8]。
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参考文献]
[1]赵辉.中国结核病防治规划实施工作指南（2008年版）对门诊医生的要求[C]//2011年山东防痨协会学术年会论文汇编.济南：山东省科学技术协会，2011：1025.
[2]王芸，许琳.云南省2000、2010年结核病流行病学抽样调查分析[J].预防医学论坛，2014，20（1）：11-19.
[3]魏巍，覃林珍，刘守江，等.实时荧光聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA诊断肺结核价值[J].临床荟萃，2014，29（6）：611-613.
[4]冯爽，站立，张丽霞，等.蛋白质组学在结核病诊断中的研究进展[J].现代预防医学，2014，41（17）：3206-3208.
[5]聂恒，吴利先.结核分枝杆菌特异性蛋白抗原研究进展及其应用策略探讨[J].中国病原生物学杂志，2014，9（2）：180-184.
[6]林楠，吴小翠，赵平，等.四种结核抗原用于结合血清学诊断的初步进展[J].实用预防医学，2014，21（6）：655-657.
[7]刘志辉，彭德虎，孟繁荣，等.结核性胸膜炎患者结核分枝杆菌培养滤液、胸腔积液和血清蛋白质组分析[J].实用医学杂志，2014，30（17）：2745-2746.
[8]孟炜丽，朱丹红，李清，等.血清腺苷脱氨酶测定在涂阴肺结核诊疗中的应用价值[J].临东荟萃，2014（11）：1228-1232.
（收稿日期：2014-12-28）