张艳平
常德职业技术学院医学系，湖南常德 415100
[摘要] 目的 观察BHRF1 shRNA质粒载体转染对人鼻咽癌CNE2细胞中的BHRF1基因沉默及细胞增殖和凋亡的影响，以及肿瘤细胞对放射敏感性的变化。方法 利用RNAi技术将负载BHRF1 shRNA的质粒载体转染至人鼻咽癌CNE2细胞，一组为BHRF1 shRNA质粒载体转染过的CNE2细胞（观察组），未进行转染的CNE2细胞确定为对照组，经RT-PCR扩增人鼻咽癌组织中BHRF1 cDNA 片段， RT-PCR和Western blot检测BHRF1基因的蛋白水平的表达。并且利用顺铂进行实验，观察使用顺铂后，BHRF1 shRNA转染后的肿瘤细胞是否对放射敏感性有变化。结果 BHRF1 shRNA转染鼻咽癌CNE2细胞后，细胞内BHRF1 mRNA表达量（2.02±0.53），对照转染前明显下调，明显下调，与对照组的（29.82±0.64）比较，差异有显著性意义（P<0.01）；DDP和8G放疗作用24 h以后，被转染的细胞的中的蛋白表达大大降低（P<0.05），癌细胞凋亡率上升，明显比对照组癌细胞的凋亡率高（P<0.05）。结论 利用RNA干扰技术对人鼻咽癌治疗具有潜在应用价值，BHRF1 shRNA质粒载体不仅仅能调控细胞基因的表达，而且还能够提高癌细胞对顺铂的敏感性。
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关键词 ] BHRF1 shRNA；CNE2细胞；BHRF1；顺铂；RT-PCR
[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）07（c）-0046-03
鼻咽癌(Nasoplmryngeal eareinorna，NPC)的发生具有明显种族和地区分布特征，对其诊断和治疗还存在着种种难点，因此，研究鼻咽癌发生和转移的分子机制，成为目前鼻咽癌研究领域的重点之一。在鼻咽癌的发生发展当中，EB 病毒( EBV ) 早期基因BHRF1(BamHI H right fragment) 是近年来新确认的一种EBV 致癌基因，其可上调抗凋亡基因P53的表达，削弱宿主对潜伏于肿瘤细胞中的EB病毒的免疫反应。基于此，本研究观察BHRF1 shRNA质粒载体转染对人鼻咽癌CNE2细胞中的BHRF1基因沉默及细胞增殖和凋亡的影响，以及肿瘤细胞对放射敏感性的变化。
1资料与方法
1.1 一般资料
选取我院2010年1月—2013年12月间收集的鼻咽癌手术患者20例为研究对象，20例患者中有5例女性15例男性，年龄从34~69岁不等，平均年龄47.3岁。所有患者确诊后进行手术，术中病理切片，并分离出人鼻咽癌CNE2细胞，将这些细胞按照患者入院编号单双号平均分为两组，一组对其进行BHRF1 shRNA质粒载体转染，设置为观察组，一组不进行转染，设置为对照组，每组10例。
Trizol totalRNA试剂盒，BHRF1 shRNA序列，由Qiagen公司合成，构建靶向表达载体，应用体外转染试剂转染CNE2细胞。
RPMI-1640完全培养基购自美国Gibco公司。
Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。
蛋白提取试剂：碧云天RIPA蛋白提取及配套试剂。
蛋白定量试剂：碧云天BCA蛋白定量试剂盒。
实验仪器：转膜仪BIO-RAD半干式转膜仪。
1.2方法
进行转染，然后RT-PCR和Western blot检测BHRF1基因的蛋白水平的表达，选取各观察点细胞，吸去细胞完全培养基，用PBS冲洗2次，直接在细胞培养皿中加入1 mL Trizol裂解细胞，用移液器反复吸打几次，然后室温下静置5 min。将细胞裂解液吸至1.5 mLEP管中，轻轻颠倒混匀，室温下静置2 min。按每1 mLTrizol中加0.2 mL氯仿的比例，加入氯仿。在蜗旋器上振荡15 s，使其充分混匀，室温下静置5 min后，离心（4℃，12000 g， 15 min），离心后，混合液分成三层，最上层为无色的水相，占总Trizol的60%。将含有RNA的水相轻轻吸取到新的1.5 mLEP管中，加入0.5 mL的异丙醇，颠倒数次使 其混匀，室温下静置10 min后， 离心（4℃，12000 g，10 min），小心吸掉上清，留取沉淀。获得的RNA经检验符合实验要求后，立即取1μg RNA进行逆转录，将mRNA反转录成cDNA，剩余的RNA保存于-80℃超低温冰箱中。具体逆转录操作按照TaKaRa 逆转录反应试剂盒（PrimeScriptTM RT Reagent Kit）操作说明执行。
取上述RT反应液加入下一步Real Time-PCR反应体系，按下列组份配制Real Time-PCR反应体系，共20 μL：10 μL Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)，0.8 μL 上游引物，0.8 μL下游引物，2 μL cDNA ，0.4 μL ROX Reference Dye (50×) ，ddH2O定容到20 μL。反应条件：预变性 95℃ 15 m；变性94℃ 60 s，退火58℃ 60 s，延伸72℃ 60 s，共40个循环。得出各标本基因和β-actin基因表达量的相关数据（Ct值），数据经内参照基因校正后，按下列公式计算PANC-1 mRNA相对表达量。公式：细胞系PANC-1 mRNA相对表达量= 2-ΔΔCt ，其中ΔCt = Ct(PANC-1)-Ct(β-actin)。数据采用仪器自带软件分析:ABI Prism 7500 SDS Software
1.3统计学方法
采用SPSS 16.0 统计软件进行统计。计数资料用率表示，采用χ2检验；相关关系采用Spearman等级相关，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 BHRF1 mRNA表达变化
RT-PCR检测结果显示，观察组的BHRF1 mRNA表达比较转染前发生显著降低(P<0.01)。与对照组细胞BHRF1 mRNA表达相比也明显降低(P<0.05)。详细数据见表1所示。
2.2 对DDP 的敏感性
为了进一步探讨BHRF1 shRNA质粒载体转染后的癌细胞后对DDP 的敏感性的变化，我们检测了两组细胞对DDP 的敏感性。经过实验，得出两组癌细胞在DDP使用以后24 h和48 h的抑制率。具体数据见下表2所示。
结果（mean±SD）说明DDP 作用24 h 和48 h以后对shRNA细胞的抑制率较NshRNA 明显更加有效(P<0.05)，说明导入BHRF1 shRNA质粒载体的细胞增加了鼻咽癌细胞对化疗药物DDP 的敏感性。
3 分析
关于BHRF1 shRNA通过何种途径发挥其抑制了鼻咽癌细胞增殖作用，本文通过实验结果已经证实。在本研究中RT-PCR检测结果显示，观察组的BHRF1 mRNA表达比较转染前发生显著降低(P<0.01)。与对照组细胞BHRF1 mRNA表达相比也明显降低(P<0.05)。说明了BHRF1 shRNA可靶向抑制BHRF1mRNA的表达，使E6蛋白表达下调，减小对p53的降解作用，从而恢复p53蛋白的功能活性，p53蛋白积累，DNA复制停止，介导细胞停滞在G1期，分析可能是其抑制鼻咽癌细胞生长的重要机理之一，该研究为进一步研究通过干扰基因表达对癌细胞增殖的抑制方面提供了理论基础。目前，临床报道的文献多采用免疫组化的方法检测到鼻咽癌组织中p53蛋白呈阳性表达，但很少发现p53基因有突变。因鼻咽癌不同于其他部位的肿瘤，癌组织内p53基因突变率极低。这就意味着野生型p53蛋白功能失活在鼻咽癌的恶性转化和肿瘤的发生发展中起着十分重要的作用。Huang等在研究p53表达与鼻咽癌及癌前病变之间的关系时指出，p53蛋白的过度表达不仅与肿瘤的发生有关，而且与鼻咽癌的分期显著相关。
而且本研究还检测了两组细胞对DDP 的敏感性，经过实验得出两组癌细胞在DDP使用以后24 h和48 h的抑制率。结果（mean±SD）说明DDP 作用24 h 和48 h以后对shRNA细胞的抑制率较NshRNA明显更加有效(P<0.05)，说明导入BHRF1 shRNA质粒载体的细胞增加了鼻咽癌细胞对化疗药物DDP 的敏感性。
综上所述，本研究利用RNA干扰技术对人鼻咽癌治疗具有潜在应用价值，BHRF1 shRNA质粒载体不仅仅能调控细胞基因的表达，而且还能够提高癌细胞对顺铂的敏感性。
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（收稿日期：2014-04-28）