武文杰1 刘瑞丽2 王 苏1 毛淑平1 李韶山1 姬明丽3
1.新乡医学院第三附属医院普外科，河南新乡 453003；2.新乡医学院药理学教研室，河南新乡 453003；3.新乡医学院生理学教研室，河南新乡 453003
[摘要] 目的 探讨TNF-α、IL-1β、IL-10在原发性肝癌患者血清水平及肝癌组织的变化，分析原发性肝癌患者TNF-α和IL-1β、IL-10表达的相关性。方法 采用酶联免疫吸附试验检测原发性肝癌及正常体检人群各63例血清中TNF-α、IL-1β和IL-10的表达，应用免疫组化方法检测63例原发性肝癌组织标本的TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白的表达情况，分析表达与原发性肝癌及组织学分型之间的关系并做相关性分析。结果 TNF-α、IL-1β在原发性肝癌患者血清中的表达高于正常体检人群，IL-10水平低于正常体检人群，差异具有统计学意义（P<0.05）。不同组织分型原发性肝癌患者血清中TNF-α、IL-1β、IL-10水平无差异（P>0.05），上述结果具有统计学意义。原发性肝癌组织中TNF-α蛋白的表达与IL-1β蛋白的表达正相关（r=0.372、P=0.000），与IL-10蛋白的表达负相关（r=﹣0.322、P =0.000）。结论 细胞微环境的改变是PLC发生发展的关键环节，慢性炎症损伤是PLC恶性生物学行为的前提，由TNF-α、IL-1β和IL-10介导的炎症反应失衡参与细胞微环境改变，并加剧肿瘤病理进程。
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关键词 ] 原发性肝癌；TNF-α；IL-1β；IL-10
[中图分类号] R735[文献标识码] A[文章编号] 1672-5654（2014）07（b）-0001-04
原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是指发生在肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤，其发生发展与细胞微环境的改变密切相关 [1-2]。细胞微环境由细胞因子（cytokine，CK）网络相互调控。细胞因子分为促炎CK和抗炎CK，促炎性CK主要有：肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α， TNF-α）、白介素-1β （interleukin-1β， IL-1β）、γ干扰素 （ interferon-γ， IFN-γ）等。抗炎性CK主要有：白介素-4（interleukin-4，IL-4）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）、白介素-13（interleukin-13，IL-13）等。本研究通过对比PLC患者和正常人血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平，检测PLC患者肝组织细胞TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白表达，探讨TNF-α、IL-1β、IL-10所调控的炎症反应失衡在PLC病理变化中的作用，为PLC的早期诊断提供实验室指标。
1资料与方法
1.1一般资料
收集2008年6月—2013年6月新乡医学院第三附属医院经影像学检查及病理学确诊的原发性肝癌患者63例，按组织来源分型：肝细胞癌47例、胆管细胞癌10例、混合细胞癌6例。确诊后均经手术治疗。随机抽取正常体检人群63例，经临床实验室检测无HBV、HCV及HIV 等病毒感染、无心脏病、高血压、肾炎、呼吸道感染等疾病，无家族肿瘤病史。
1.2主要试剂
人TNF-α酶联检测试剂盒、人IL-1β酶联检测试剂盒、人IL-10酶联检测试剂盒、鼠抗人TNF-α免疫组化试剂盒、鼠抗人IL-1β免疫组化试剂盒、鼠抗人IL-10免疫组化试剂盒均购于北京博奥森生物技术有限公司。
1.3 研究方法
所有原发性肝癌患者及正常体检者均在晨起6：30-7：00空腹外周静脉采血，分离血清置-20℃冰箱保存，实验前迅速解冻，严格按照说明书进行双抗体夹心ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β和IL-10水平。原发性肝癌患者手术切除的肿瘤组织标本修剪成若干1cm3大小组织块， 4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，备免疫组化分析。
1.4 统计学处理
使用SPSS 13.0统计学软件处理数据，原发性肝癌患者及正常体检人群血清TNF-α、IL-1β和IL-10水平比较、不同组织分型肝癌患者血清TNF-α、IL-1β和IL-10水平比较采用单因素方差分析及LSD-t检验。原发性肝癌组织中TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白的表达相关性分析采用Spearman秩相关分析。检验水准a=0.05。
2结果
2.1 PLC患者及正常体检人群血清中TNF-α、IL-1β和IL-10水平比较
PLC患者血清TNF-α、IL-1β水平高于正常体检人群，差异具有统计学意义（F = 21.615，p = 0.000；F = 18.026，p = 0.000 ）。PLC患者血清IL-10水平低于正常体检人群，差异具有统计学意义（F = 16.152，p = 0.000）。见表1。
2.2不同组织分型PLC患者血清中TNF-α、IL-1β和IL-10水平比较
肝细胞癌、胆管细胞癌、混合细胞癌3种组织分型的PLC患者血清中TNF-α水平相比无差异（F=2.042，P=0.051；F=1.815，P =0.148；F=2.663，P=0.650）；3种组织分型的PLC患者血清中IL-1β水平相比无差异（F=2.150，P =0.051；F=1.412，P=0.074；F= 2.627，P= 0.605）；3种组织分型的PLC患者血清IL-10水平相比无差异（F=2.125，P=0.225；F=1.162，P=0.182；F=2.325，P=0.142）。上述结果具有统计学意义，见表2~表4。
2.3 PLC组织中TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白的表达及相关性分析
TNF-α、IL-1β和IL-10免疫反应阳性物质均表达在细胞浆，DAB显色呈棕黄色颗粒为表达阳性，采用半定量法[3]判断上述三种蛋白的表达情况：随机选10个高倍视野，显色的阳性反应细胞数<25%为+，25~50%为++，>75%为+++，无明显阳性反应细胞为-，见图1~图3和表5。PLC组织中TNF-α蛋白的表达与IL-1β蛋白的表达正相关（r=0.372、P=0.000），与IL-10蛋白的表达负相关（r=﹣0.322、P=0.000）。结果具有统计学意义，见表5~6。
3讨论
PLC是全球常见恶性肿瘤之一，死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第3位，由于缺乏特征性的实验室检测指标，早期确诊困难，临床干预较晚，患者预后差[2]。研究表明原发性肝癌的发生与细胞微环境的改变密切相关[1-4]。TNF-α是CK网络调控中重要部分，可由单核巨噬细胞、T细胞及和肥大细胞产生释放，是炎症反应的始动因子之一，可在分子水平刺激产生众多有助于肿瘤生长和存活的物质，是细胞微环境改变的关键[5-7]。IL-1β又名淋巴细胞活化因子，在炎性反应的发生发展过程中起继发作用，高水平持续存在的 IL-1β 可促发广泛的慢性炎症反应和组织破坏，是导致肿瘤发生和生物学行为恶化的重要因素[8]。IL-10是一种多效性的抗炎CK，可广泛抑制促炎CK的产生和减弱致炎信号转导，下调炎症反应，减轻肿瘤的恶性生物学行为[9-10]。本研究通过对比PLC患者和正常人血清中三者水平，检测PLC组织细胞三者表达之间的关系，以期为PLC的早期临床诊断提供实验室依据。
本研究结果显示PLC患者血清TNF-α、IL-1β的水平高于正常体检人群，而IL-10的水平低于正常体检人群，且在PLC不同组织分型癌组织中的表达没有差异。TNF-α的促炎作用主要表现在做为前炎因子诱导血管内皮细胞释放内皮细胞黏附分子，激活炎细胞的聚集释放反应，此外TNF-α还是炎症反应的启动因子，刺激或促进白介素类细胞因子的释放，进一步扩大炎症反应。IL-1β做为白介素类细胞因子作用最强的炎症介质之一，在局部和全身炎症反应中起继发作用。提示PLC患者促炎CK TNF-α、IL-1β表达上调，抗炎CK IL-10的表达下调，且这种炎症CK的表达改变在PLC的病理变化中是普遍现象，即TNF-α始动的、IL-1β和IL-10参与介导的炎症反应的失衡是PLC的病理变化中的重要因素。这也与Leonardi等[1-11]的研究结果一致。
本文研究结果中还显示PLC组织中TNF-α蛋白的表达与IL-1β蛋白的表达正相关（r=0.372、P=0.000），与IL-10蛋白的表达负相关（r=﹣0.322、P=0.000），进一步证实了TNF-α、IL-1β和IL-10介导的细胞微环境的改变与PLC的发生发展密切相关。TNF-α一方面可以启动炎症级联反应，带来组织细胞的慢性炎症损伤，另一方面通过促进多种黏附分子的表达促进肿瘤的浸润转移，使肿瘤生物学行为恶化；IL-1β一方面促进炎症反应和炎症损伤的扩大，一方面促进恶性细胞分泌生长因子、血管生成因子和黏附分子来加速肿瘤的生长、浸润和转移[12-13]。而IL-10的表达与TNF-α表达的负相关性[14]，进一步说明在PLC肿瘤组织细胞的恶性生物学行为过程中抑制性介质的减少，扩大炎症级联反应失衡，进一步损害细胞微环境，是PLC发生发展的重要环节。
综上所述，细胞微环境的改变是PLC原发性肝癌发生发展的关键环节，慢性炎症损伤是PLC恶性生物学行为的前提，由TNF-α、IL-1β和IL-10介导的炎症反应失衡参与了细胞微环境改变，并加剧加重了肿瘤病理进程。 这3种介质在PLC患者血清和组织细胞表达的变化可以为临床医师诊断PLC提供依据，尽早开展临床干预，改善患者预后。
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（收稿日期：2014-04-10）