何衡杰 郝 丽
安徽医科大学第二附属医院肾内科，安徽合肥 230601
[摘要]目的 探讨安徽汉族超重者与正常体重者脂肪组织中TNF-α基因的差异表达,分析TNF-α基因的表达与年龄（AGE）、体重指数(BMI)、腰围尺寸(WC)、腰臀比例(WHR)的相关性。方法 以肌动蛋白（β-actin）基因作为内参照，用半定量RT-PCR方法检测网膜脂肪组织与皮下脂肪组织的TNF-α基因在24例正常体重者（BMI在18.5～24 kg/m2之间）和19例超重者(BMI 在24～28 kg/m2之间)中的不同表达水平，并通过测量实验者的一系列指标，有体重、身高、臀围、腰围等，在此基础上计算出腰臀比例和体重指数，分析比较这些参数与TNF-α基因表达的相关性。结果 腹部皮下与网膜脂肪组织中的TNF-α基因表达水平在超重组与正常体重组间差异均无显著性；超重组组内与正常体重组组内的皮下及网膜脂肪的TNF-α基因表达差异亦无显著性；WHR、WC与皮下及网膜的TNF-α基因表达相关性为正向。结论 皮下及网膜脂肪组织TNF-α基因表达在超重组中无明显增强, 但与WHR、WC呈正相关。
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关键词 ] 肿瘤坏死因子; 脂肪组织; 超重
[中图分类号] R725 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）08（b）-0013-03
Expression of tumor necrosis factor alpha in subcutaneous and omental adipose tissues of overweight person
HE Hengjie, HAO Li
Dept of Endocrinology, The 2st Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230601 ,China
[Abstract] Objective To investigate the expression of tumor necrosis factor alpha in adipose tissues of Anhui Han nationality between over-weight and control group, and the relationship with AGE, BMI, WC, WHR. Methods The TNF-α expression level was measured by semi-quantitative RT-PCR in abdominal subcutaneous and omental adipose tissues of 24 normal controls (BMI: 18.5~24 kg/m2) and 19 over-weights (BMI: 24~28 kg/m2). Anthropometric data, such as height, body weight, waist circumference, hip circumference; and waist to calculate waist-hip ratio (WHR) and body mass index (BMI). Insulin resistance index were calculated. Compare these parameters with TNF- α gene expression by correlation analysis. Results The level of TNF-α gene expression have no significant difference between overweight and control group, respectively; There were no differences between subcutaneous and omental adipose tissues from each subject. WHR and WC were found to have significant positive correlation with the expression of TNF-α gene in subcutaneous and omental adipose tissues. Conclusion The gene expression levels of TNF-α was positively correlated with WHR and WC, but have no obviously increasing in the over-weight group when compared with the control group.
[Key words]Tumor Necrosis Factor Alpha; Adipose Tissue; Overweight
近年来许多研究证实了肿瘤坏死因子与胰岛素抵抗有关，且肥胖者脂肪分泌的肿瘤坏死因子可能是正常者的数倍。但对于为数众多的超重者，相关文献相对较少。本实验旨在观察是否超重者脂肪组织也存在TNF-α基因表达增强，正常及超重者腹部皮下脂肪组织及网膜脂肪组织的TNF-α基因表达有无差异。
1对象与方法
1．1 研究对象
均为在安徽医科大学第二附属医院普外科做手术的安徽汉族人，排除了感染、肝脏疾病及其他内分泌代谢疾病等。实验的分类标准为《中国成人超重与肥胖症预防与控制指南》，2003年该指南由中国肥胖问题工作组编写，超重组19人，BMI在24～28 kg/m2之间，年龄为22~75岁，平均年龄48.9岁;正常组24人, BMI 在18.5～24 kg/m2之间, 年龄为33~70岁，平均年龄为51.2岁；二组年龄及性别基本匹配。
1．2 方法
1．2．1手术时取腹部皮下、网膜脂肪组织，取样后用液氮迅速冷冻并低温保存。按QIAGEN公司提供RNeasy Mini Kit试剂盒说明书要求提取脂肪组织总RNA。紫外分光光度仪测定及琼脂糖电泳判断RNA质量。根据基因特异性cDNA序列，通过软件primer 5.0设计特异性扩增引物，扩增TNF-α基因的特异性引物，上游序列为：5ˊ-GTGACAAGCCTGTAGCCCAT-3ˊ，下游序列为：5ˊ-TAGATGGGCTCATACCAGGG-3ˊ，扩增片段长度331bp；扩增β-actin基因的引物，上游序列为：5ˊ-GCTATCCAGGCTGTGCTATC-3ˊ，下游序列为：5ˊ-CAGCACTGTGTTGGCGTACA-3ˊ，扩增片段长度495 bp。RT-PCR：总RNA2 uL，5倍逆转录反应缓冲液4 uL,Oligo (dT)18 2.5 uL,RNA酶抑制剂0.5 uL,逆转录酶AMV 2 uL,dNTP 8 uL,加DEPC处理水至20 uL,28℃放置10 min，42℃温育2 h，99℃5 min灭活逆转录酶。PCR反应体系中包括：模板10 uL，10倍PCR反应缓冲液5 uL，4种混合单核苷酸4 uL，肿瘤坏死因子上下游引物及β-actin上下游引物各1.0 uL,Taq酶0.7uL,加DEPC处理水至反应总体积50 uL。第一步：94℃预变性1 min；第二步：30个循环 即94℃变性32s，59.9℃退火40s，72℃延伸1 min；第三步：72℃再延伸4 min[1]。1.2%的琼脂糖凝胶电泳反应产物，通过凝胶成像分析系统来测定每个单独条带的亮度，并在此基础上计算出条带的光密度比值（TNF-α/β-actin），见图1。
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0:分子量标准DL 2,000; 1-4: 腹部皮下及网膜脂肪组织中TNF-α和β-actin 基因PCR产物。
1．2．2 测身高、体重，腰围（腰围测量是以腋中线肋下缘与髂骨上缘间中点水平周长）、臀围（臀围为以耻骨联合水平测量臀部的最大周长），并在以上的基础上计算腰臀比例和体重指数。
1．3 统计学处理
采用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，组间比较采用t检验，相关因素采用线性相关分析。
2结果
2．1 各组光密度比值之间的两两比较
TNF-α基因在超重组的皮下脂肪组织表达变化较正常组略有增强，但差异无显著性( P>0.05)；TNF-α基因在网膜脂肪组织的表达变化比正常组也略有增强，差异无显著性( P>0.05)；所以说，在超重组和正常组中，皮下与网膜的基因TNF-α表达变化的差异没有统计学意义(P>0.05)。
2．2 TNF-α基因在皮下与网膜的表达与各指标的双变量相关性分析
皮下的TNF-α基因表达与WC（γ=0.420, P<0.05）、WHR（γ=0.416, P<0.05）成正相关;网膜的TNF-α基因表达与WC（γ=0.360, P<0.05）、WHR(γ=0.368,P<0.05)成正相关；BMI、AGE与两种组织的TNF-α基因表达没有相关性（见表1）。
3 讨论
脂肪组织的细胞在发生肿瘤时会表达和释放一种产物叫肿瘤坏死因子，其中TNF-α基因可能存在两种分泌途径，即旁分泌和自分泌，从而刺激脂肪细胞发生分解消失，另外会通过减少LPL的生成并减弱其活性，从而生成脂肪细胞的能力变弱，还会通过干扰诱导前脂肪细胞的分化和刺激成熟脂肪细胞逆分化两种方式来阻扰脂肪细胞发生分化，从而使得前脂肪细胞和脂肪细胞的凋亡速度加快，最终防止扩大了脂肪组织的整个体积[2-3]。
近年来，有一些关于TNF-α基因表达与肥胖和超重的研究。首先，前人发现在肥胖组的脂肪组织中TNF-α基因表达量有所增加，而随着体重的减轻，基因TNF-α表达量随之减少[4]。然而在对人类的研究上发现分歧：BMI为体重指数，其中BMI > 30kg／m2为超重组，BMI ＜ 25 kg／m2为正常组，对两组对比发现，超重组的皮下和细胞中TNF-a 基因会过度表达，约为对照组中TNF-a 基因表达的2.5倍[5]，Bullo等对96例妇女的研究表明，TNF-α基因表达与脂肪容量成比例关系[6]；但也有不同的结果，前人对39位体重指数各异的人为研究对象，结论是BMI与脂肪组织中TNF-α基因表达变化呈现出正相关只限于体重指数介于27~45kg/m2者，高度肥胖者则不在此列[7]；得出相反的结论是Koistinen和李晓男等的研究，显示消瘦和肥胖者皮下脂肪组织的TNF-α基因基因表达基本无差异[8-9]，本实验通过对19例超重者和24例对照者的研究显示超重组皮下脂肪组织TNF-α基因表达比正常体重组略有增强，没有统计学意义，与前人结果相符。但是还存在不同的研究结果，Montague等通过试验发现人体腹部的皮下和网膜的TNF-α基因表达是一致的[10]；本实验中网膜的TNF-α基因表达较正常组也略有增强，但同样无显著性差异；超重组与正常组的皮下与网膜之间的TNF-α基因表达比较发现，P值均大于0.05，差异不显著，与Montague等的结果相符。两组合并后相关分析显示WC、WHR与在皮下及网膜中表达基因TNF-α的变化相关性为正向的，与BMI、AGE与此基因无相关性。提示两种脂肪组织TNF-α基因表达随中心性肥胖体型的趋势而上升，并且和体重指数具有密切的关系。
本实验通过对超重者19例和对照者24例的比较研究显示：超重组皮下及网膜脂肪组织的TNF-α基因表达无明显增强，无论是超重组还是正常组，皮下与网膜之间的TNF-α基因表达比较，不存在统计学意义。
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参考文献]
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（收稿日期：2014-06-12）