黄旭晖 张晓文 梁荣华 郭苇 陈燕銮 王昌俊
【摘要】目的 通过建立小鼠肝癌休眠模型，并予健脾化瘀法干预，研究其促进肿瘤休眠的作用及其免疫机制。方法建立小鼠肝癌休眠模型。并随机分为4组：空白对照组、化疗对照组、中药低剂量组、中药高剂量组，分别给予生理盐水、卡莫氟、中剂量健脾化瘀方及高剂量健脾化瘀方进行干预。处死小鼠后，接种部位取材，免疫组化染色检测Ki-67、TGF-β、IL-10等相关指标的表达。结果①肿瘤组织休眠情况：在反复外伤刺激下，空白对照组休眠率为0。化疗对照组休眠率为80.0%。中药低剂量组和高剂量组休眠率均为86.7%；②对Ki-67增殖指数的影响：化疗对照组、中药低剂量组、中药高剂量组与空白对照组两两比较，其Ki-67增殖指数均低于空白对照组（p＜0.05）；中药低剂量组、中药高剂量组与化疗对照组两两比较，均低于化疗对照组（p＜0.05）；而中药低剂量组及高剂量组间两两比较无明显差异（p＞0.05）；③对TGF-β表达水平的影响：化疗对照组、中药低剂量组、中药高剂量组与空白对照组两两比较，空白对照组TGF-β表达水平明显高于前三组（p＜0.05）；但化疗对照组、中药低剂量组与中药高剂量治疗组间两两比较，TGF-β表达水平无明显差异（p＞0.05）；④对IL-10表达水平的影响：化疗对照组、中药低剂量组、中药高剂量组与空白对照组两两比较，空白对照组IL-10表达水平明显高于前三组（p＜0.05），但化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组间两两比较，IL-10表达水平无明显差异（p＞0.05）。结论健脾化瘀方有促进小鼠肝癌休眠的作用，其作用机制可能与其通过调节免疫抑制肿瘤细胞的TGF-β、IL-10表达有关。
【关键词】健脾化瘀 肿瘤休眠 免疫调节
基金项目：广东省中医药局建设中医药强省科研课题（编号： 20121259）
黄旭晖 陈燕銮 王昌俊：广东省人民医院/广东省医学科学院广东广州510080
张晓文：广州市体育科学研究所广东广州510650
梁荣华 郭苇：广州中医药大学广东广州510405
黄旭晖王昌俊：广东省老年医学研究所广东广州510080
通讯作者：王昌俊
【Abstract】ObjectiveTo study the effects of Jianpi Huayu formula on the promotion of tumor dormancy and the immune mechanism in mice with hepatic carcinoma by building tumor dormancy model of hepatoma in mouse intervened with Jianpi Huayu formula. Methods
A tumor dormancy model of hepatoma in mouse was established. Mice were randomly divided into four groups： blank control group， chemotherapy control group， low-dosage Traditional Chinese medicine （TCM） group， high-dosage TCM group， intervened with normal saline， carmofur， middle-dosage Jianpi Huayu formula and high-dosage Jianpi Huayu formula respectively. After the mice were sacrificed， immunohistochemical staining was performed in the vaccinated parts extracted from mice to detect the expression of relevant indicators including ki-67， TGF-β and IL-10. Results
①Tumor dormancy situations： After repeated traumatic stimulation， tumor dormancy rates of blank control group and chemotherapy control group were 0 and 80.0 % respectively. The tumor dormancy rates of low-dosage and high-dosage TCM groups were both 86.7%. ②Effects on Ki-67 proliferation index： Ki-67 proliferation indexes of chemotherapy control group， low-dosage and high-dosage TCM groups were lower than that of blank control group （p<0.05）. Ki-67 proliferation indexes of low-dosage and high-dosage TCM groups were lower than that of chemotherapy control group （p<0.05）.There was no significant difference between Ki-67 proliferation indexes of low-dosage and high-dosage TCM groups （p>0.05）. ③ Effects on expressions of TGF-β： The expressions of TGF-β in chemotherapy control group， low-dosage and high-dosage TCM groups were significantly lower than that in blank control group （p<0.05）. There was no significant difference in expressions of TGF-β between chemotherapy control group， low-dosage and high-dosage TCM groups （p>0.05）. ④ Effects on the expressions of IL-10： The expressions of IL-10 in chemotherapy control group， low-dosage and high-dosage TCM groups were significantly lower than that in blank control group （p<0.05）. There was no significant difference in expressions of IL-10 between chemotherapy control group， low-dosage and high-dosage TCM groups （p>0.05）. ConclusionJianpi Huayu formula plays a role in promoting tumor dormancy in mice with hepatic carcinoma by adjusting the immunity and suppressing the expressions of TGF-β， IL-10 in tumor cells.
【Key words】 Jianpi Huayu， Tumor dormancy， Immunoregulation
【Author′s address】Guangdong Provincial People’s Hospital / Guangdong Academy of Medical Sciences / Guangdong Institute of Gerontology， Guangzhou 510080， Guangdong Province， China
doi：10.3969/j.issn.1671-332X.2014.09.007
肿瘤治疗的难点在于肿瘤治疗后易发生复发转移。目前研究认为，肿瘤治疗后存在休眠的肿瘤细胞，其后在一定条件下，由于机体免疫功能降低，免疫监视能力下降，肿瘤细胞通过免疫逃逸而打破休眠状态，导致肿瘤发生转移和增殖［1］。肿瘤休眠现象在临床上非常普遍，已经被许多临床及动物实验证据所证实［1-2］。逆转肿瘤细胞免疫逃逸和促进肿瘤细胞休眠方面的研究正成为近年来的研究热点［2］。
健脾化瘀法在既往研究的体内外实验中均显示出较好的抗肝癌效应。本研究拟通过建立小鼠肝癌休眠模型，并予健脾化瘀法干预，研究其促进肿瘤休眠的作用及其免疫机制，为其临床应用及进一步研究促肿瘤休眠药物提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1肿瘤细胞液取6～8周龄的雄性昆明种小鼠，体重在20～25 g，予H22腹水型肝癌细胞株（由中山大学动物实验中心提供）腹腔接种传代，至第7天，在无菌条件下，抽取腹水3 ml，显微镜下计数细胞数为1.0×108/ml。取1 ml腹水+9 ml灭菌生理盐水配制成浓度为1.0×107/ml的接种用肿瘤细胞液。
1.1.2实验动物选取6～8周龄的清洁级昆明种小鼠，体重在20～25 g，雌雄各半，共80只（由中山大学实验动物中心提供，许可证号SYXK（粤）2007-0081）。
1.1.3药物的制备①中药提取液：健脾化瘀方由莪术、白术、茯苓、苦参、佛手、白花蛇舌草等组成。按组方比例取药，分别提取药物的挥发油及水溶性成分，加入适量蒸馏水，充分混匀后制成中药提取液，使每1.0 ml中药提取液相当于健脾化瘀方生药1.0 g，灭菌、低温下密封保存备用，每次使用前摇匀。②卡莫氟混悬液：卡莫氟（HCFU）标准品50 mg（由广东省药检所提供），研成均匀细末后，加入50 ml蒸馏水，充分混匀后配制成混悬液，浓度为1.0 mg/ml，灭菌、低温下密封保存备用，每次使用前摇匀。
1.2方法
1.2.1肝癌小鼠休眠模型的建立及分组按文中所述方法，建立肝癌小鼠休眠模型［3］。随机选出60只肝癌休眠模型小鼠，并按随机数字表法，将模型小鼠随机分为4组：空白对照组、化疗对照组、中药低剂量组、中药高剂量组，每组各15只模型小鼠。
1.2.2给药方法空白对照组：分别取1.0 ml生理盐水予每只小鼠灌胃，每天1次；化疗对照组：分别取0.6 ml卡莫氟混悬液（用生理盐水稀释成1.0 ml）予每只小鼠灌胃，每天1次；中药低剂量组：分别取0.3 ml中药提取液（用生理盐水稀释成1.0 ml）予每只小鼠灌胃，每天1次；中药高剂量组：分别取0.5 ml中药提取液（用生理盐水稀释成1.0 ml）予每只小鼠灌胃，每天1次；分组后第2天，全部小鼠开始给药，同时，每2天截掉 2 mm长的一段尾巴作为外伤刺激，重复4次，共给药21天。最后一次给药后第2日，以颈椎脱臼法处死全部小鼠。
1.3标本检测
1.3.1收集标本处死全部小鼠后，对每只小鼠进行解剖，观察全身组织器官情况并记录，取出模型小鼠的腋下接种处组织，制备成石蜡切片以用于检测。
1.3.2观察腋下肿瘤组织休眠情况每日对小鼠腋下肿瘤组织情况进行观察并记录，如肉眼观察到腋下肿瘤组织生长，每日对荷瘤鼠肿瘤组织的最长径（a）及与其垂直的最短径（b）进行测量和记录，对肿瘤瘤体的体积进行计算（体积公式 v=1/2×a×b2）。
1.3.3检测Ki-67增殖指数（PI）Ki-67染色阳性表达为细胞浆或核内呈棕黄色或棕褐色。在低倍镜下随机选择5个视野，在每个视野下换用400倍显微镜，计数每个视野下肿瘤细胞总数及Ki-67阳性增生细胞数并进行记录，每个切片至少计数1 000个细胞，并按以下计算公式计算出每个切片Ki-67增殖指数，同一组取平均值，得出每组的增殖指数。Ki-67增殖指数按以下公式计算：Ki-67增殖指数（PI） =Ki-67阳性增生细胞数/肿瘤细胞总数×100%。
1.3.4TGF-β和IL-10的检测阳性表达为细胞胞质中染色呈棕黄色或棕褐色。在低倍镜下随机选择5个视野，在每个视野下换用200倍显微镜，计数每个视野下肿瘤细胞总数及阳性细胞数并进行记录，按半定量方法进行评分。表达越高，其半定量分级水平越高。
1.4统计学分析
应用SPSS 11.0统计软件进行处理，各组间计数资料比较采用卡方检验，各组内计量资料比较采用t检验，各组间计量资料比较采用方差分析，以p＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1肿瘤组织休眠情况
可以观察到，在外伤刺激下，空白对照组小鼠腋下接种处从第9天开始肉眼可观察到肿瘤包块，至第16天，空白对照组全部15只小鼠肉眼可观察到腋下接种处肿瘤包块。而化疗对照组共观察到有3只小鼠重新出现腋下接种处肿瘤包块，肿瘤休眠率为80.0%。而中药低剂量组、中药高剂量组各有2只小鼠重新出现腋下接种处肿瘤包块，肿瘤休眠率均为86.7%，见表1。此提示经反复外伤刺激，肝癌休眠模型小鼠体内休眠的肿瘤细胞，可再度激活并发生重新增殖，从而导致肿瘤复发，而对于促进和维持肿瘤细胞的休眠状态，化疗对照组及中药低剂量组、中药高剂量组均有作用。
2.2健脾化瘀方对Ki-67增殖指数表达的影响
化疗对照组、中药低剂量组、中药高剂量组与空白对照组两两比较，其Ki-67增殖指数均低于空白对照组（p＜0.05）；中药低剂量组、中药高剂量组与化疗对照组两两比较，均低于化疗对照组（p＜0.05）；而中药低剂量组及高剂量组间两两比较无明显差异（p＞0.05）；此提示，化疗对照组、中药低剂量组及高剂量组均有抑制肿瘤细胞增殖的作用，与化疗对照组比较，中药低剂量组及高剂量组抑制肿瘤细胞增殖的作用较强，但抑制肿瘤细胞增殖的作用两中药治疗组之间差异不明显，见表2、图1。
2.3健脾化瘀方对TGF-β表达水平的影响
化疗对照组、中药低剂量组、中药高剂量组与空白对照组两两比较，其TGF-β表达水平均低于空白对照组（p＜0.05）；中药低剂量组、中药高剂量组与化疗对照组两两比较，其TGF-β表达水平无明显差异（p＞0.05）。此提示，对于肿瘤细胞 TGF-β的表达水平，化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组均有抑制作用，但三组之间两两比较，其抑制作用无明显差异，见表3、图2。
表3各组小鼠TGF-β表达水平（n，%）
2.4健脾化瘀方对IL-10表达水平的影响
化疗对照组、中药低剂量组、中药高剂量组与空白对照组两两比较，其IL-10表达水平均低于空白对照组（p＜0.05）；中药低剂量组、中药高剂量组与化疗对照组两两比较，其IL-10表达水平无明显差异（p＞0.05）。此提示，对于肿瘤细胞IL-10的表达水平，化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组均有抑制作用，但三组之间两两比较，其抑制作用无明显差异。见表4、图3。
3讨论
人体在肿瘤发生、发展和转移过程中形成了免疫微环境。机体免疫微环境可以有效监视肿瘤，产生肿瘤免疫反应，杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长。但肿瘤细胞可通过对自身表面抗原的修饰及分泌多种抑制性细胞因子，逃避机体免疫系统的监视和杀伤，诱导肿瘤细胞免疫逃逸和耐受的发生。目前认为转化生长因子β（TGF-β）和白介素-10（IL-10）是其中最重要的两种抑制性细胞因子。
在肿瘤进展期，肿瘤细胞合成大量TGF-β，随着TGF-β表达水平的升高，TGF-β主要表现为促肿瘤生长作用［4］。其原因考虑与TβRⅠ、TβRⅡ受体的缺失、突变和/或表达水平的降低，还有TGF-β/Smads信号通路的调节障碍有关。一方面，肿瘤细胞对TGF-β抗增殖作用因受体和信号通路系统的突变产生抵抗，同时，TGF-β本身可广泛抑制机体免疫系统，阻断淋巴细胞的正常增殖和分化，介导肿瘤细胞免疫逃逸，从而促进肿瘤的生长增殖［5-6］。另一方面，通过增加肿瘤细胞与胞外基质间的作用、激活肿瘤微血管生成等，TGF-β具有促进肿瘤侵袭和转移的作用［7-8］。近年来研究表明，TGF-β是介导肝癌细胞免疫逃逸的主要免疫抑制因子之一，与肿瘤特别是肝癌的发生发展有着密切的关系［9-10］。
而IL-10在几乎所有恶性肿瘤中表达都增强，是在肿瘤免疫中发挥着显著作用的免疫抑制性细胞因子［11-12］。其主要通过抗原提呈细胞（APC），尤其是淋巴细胞而发挥其效应［13］。IL-l0的作用机制可能与以下因素有关：①抑制T细胞，阻止CD4+T细胞的增殖，将肿瘤细胞转化为CTL-抗性表型，使CTL失去免疫功能［14］；②通过阻止单核细胞分化成DC，促进DC凋亡，从而减少DC的生成和表达而抑制免疫。
同时，调节性T细胞（Treg）可以与TGF-β、IL-10产生恶性自分泌循环，具有协同效应。一方面，TGF-β可促进Treg细胞的扩增，而扩增的Treg细胞又可反过来进一步促进TGF-β、IL-10的分泌［15-16］，加强抑制效应T细胞和树突状细胞（DCs）的功能，如此反复循环，从而加重肿瘤免疫抑制状态。
临床上不同种类的肿瘤虽表现为脾虚湿阻、气滞血瘀、热毒内蕴、气血两虚等不同证型，但脾虚、血瘀这一基本病机贯穿不同类型肿瘤病程的始终。以健脾益气，化瘀散结为法的中药复方制剂对于防治肿瘤复发和转移在临床和动物实验中均具有确切的疗效，显示出较好的抗肝癌效应［17-20］。
本研究通过对肝癌术后休眠模型小鼠给予健脾化瘀方进行干预，同时予外伤截尾刺激以打破肿瘤细胞休眠状态，结果发现健脾化瘀方可抑制肿瘤细胞增殖，有促进和维持肿瘤细胞的休眠状态的作用。而经过健脾化瘀方干预后，中药低剂量治疗组及高剂量治疗组其TGF-β和IL-10表达明显降低，说明健脾化瘀方能调节肿瘤免疫，抑制肿瘤细胞免疫抑制性细胞因子TGF-β、IL-10的表达。而健脾化瘀方促进与维持肿瘤休眠的作用机制可能与其调节免疫的作用有关。
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