林 超 艾文兵 熊志云 彭 智 冯定坤 孙 欢
三峡大学医学院神经外科，湖北宜昌 443000
[摘要] 目的 探讨nm23-H2抗体对C6胶质瘤细胞MMP-2蛋白表达量及其磷酸化的影响，并探讨其意义。 方法 将C6细胞常规培养后,按加入nm23-H2抗体的浓度分对照组（0 mg/L）、低浓度组（20 mg/L）和高浓度组（40 mg/L）3组，通过采用免疫组化、Western法检测C6细胞中MMP-2蛋白表达量及磷酸化的变化。 结果 Western 结果显示，各实验组中，MMP-2表达量及其磷酸化程度随nm23-H2抗体浓度的增高呈降低趋势，表现为剂量依赖性关系，3组相互比较，差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组化结果显示：对照组MMP-2阳性细胞数为（61.60±6.60）%，低浓度组为（31.00±5.94）%，高浓度组为（17.57±6.15）%，3组相互比较，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 nm23-H2对C6细胞MMP-2蛋白表达量及磷酸化起调节作用，使用特异性抗体对其拮抗后，MMP-2蛋白表达量及磷酸化水平均呈下降趋势。
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关键词 nm23-H2；神经胶质瘤；MMP-2
[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）12（a）－０042-02
现已研究发现，nm23-H2是Rho-GTPases/nm23信号通路的重要分子，可通过影响Rho蛋白的活性而干扰细胞的侵袭[1]；由于上述胶质瘤细胞的侵袭行为与MMP-2同样有重要的关联。因此，nm23-H2 在细胞内是否可以通过影响MMP-2而发挥作用有待进一步探索。该研究2014年2—7月间采用不同浓度的nm23-H2抗体处理C6细胞，观察其对MMP-2蛋白的表达量及其磷酸化的影响，并探讨其作用机制，以期为脑胶质瘤的治疗提供实验依据，报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
实验自2014年2月开始，2014年7月结束。C6细胞由华中科技大学免疫学教研室提供；nm23-H2抗体；抗MMP-2抗体，HRP-羊抗兔LgG等均购自武汉博士德生物有限公司，纤连蛋白、新生小牛血清及常规生化试剂、仪器设备均由三峡大学分子生物学实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与分组 大鼠C6细胞常规培养，待其进入对数生长期后，调整细胞培养浓度为1×104～1×105/mL，并按nm23抗体加入的浓度分为对照组（0 mg/L）、低浓度组（20 mg/L）和高浓度组（40 mg/L）3组。20 h后收集细胞样品，并加入0.4 mLRIPA裂解液，取上清备用。
1.2.2 Western Blot法检测C6细胞中MMP-2蛋白 样品行SDS-PAGE，电转移于PVDF膜上，常规封闭液处理2 h，依次加入一抗（抗MMP-2抗体1∶2 000稀释，和羊抗兔二抗（1∶3 000），室温作用1 h后显影。Image J软件检测各组MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均数。
1.2.3 免疫组化法检测C6细胞中MMP-2蛋白表达 调整C6细胞浓度为1×104/mL，依次加入不同浓度的nm23-H2抗体，后依次滴加MMP-2一抗（1∶200 0）、IgG二抗， 于室温孵育 1 ~2h。后加入SABC试剂， PBS 漂洗后DAB 显色，切片在高倍镜下观察并计数。
1.3 统计方法
采用SPSS 19.0统计软件对数据进行处理，所有数据以均数±标准差（x±s）表示，进行 t检验。
2 结果
2.1 Western blotting法检测 nm23-H2抗体对C6细胞MMP-2蛋白表达量及磷酸化的影响
如图1～4所示，不同浓度nm23-H2抗体对MMP-2的表达量及磷酸化均有明显抑制作用，随着浓度的增加，其对MMP-2蛋白表达及磷酸化的抑制作用呈增强趋势。
图1、2所示，随着nm23-H2抗体浓度的升高，MMP-2蛋白表达量及磷酸化均呈下降趋势，图3、4均为内参。注：1为对照组，2为低浓度组（20 mg/L），3为高浓度组（40 mg/L）。
2.2 Image J软件检测各组MMP-2、磷酸化MMP-2、β-actin蛋白条带平均光密度比值均数
随nm23-H2处理浓度的增加，MMP-2蛋白及磷酸化MMP-2/β-actin光密度比值呈下降趋势，3组相比，差异有统计学意义（P<0.05)，见表1。
2.3 免疫组化法检测nm23-H2抗体对胶质瘤细胞MMP-2表达的影响
随nm23-H2处理浓度的增加，细胞MMP-2阳性细胞数减少，且效果与剂量呈正相关。3组相互比较，差异有统计学意义（P<0.05)，见表2。
3 讨论
现已发现，Rho-GTPases/nm23是一种新近发现的脑胶质瘤信号通路，该通路所涉及的蛋白表达量与细胞的恶性程度密切相关。已证实，通路中的核心蛋白nm23-H2具有3种酶的活性作用：组氨酸蛋白激酶、二磷酸核苷激酶、3´-5´核酸外切酶活性[2]。对多个胞内外蛋白存在影响[3]。该结果显示，MMP-2表达量及其磷酸化程度随nm23-H2抗体浓度的增高呈降低趋势，表现为剂量依赖性关系，且差异有统计学意义（P<0.05）。目前研究认为，在众多肿瘤的恶性生长过程中，MMP-2的激活是最关键的环节之一。其本身磷酸化的程度直接关系到蛋白的活性状态，与MMP-2部分基团的甲基化同等重要[4]。在该研究结果提示MMP-2可能受nm23-H2上游的干扰和调控。免疫组化的结果显示：对照组MMP-2阳性细胞数为（61.60±6.60）%，低浓度组为（31.00±5.94）%，高浓度组为（17.57±6.15）%，3组相互比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与Western 检测结果基本吻合。国内外其他学者也发现，当有效抑制nm23-H2活性后，可明显抑制肿瘤细胞向周围组织的侵袭。由于nm23-H2在细胞内的浓度不同，对肿瘤细胞中MMP-2的干预作用自然不同[5]。MMP-2在胞浆升的高表达往往提示肿瘤可能早期就已侵袭正常组织。其次，在胶质瘤的生长微环境下，随着MMP-2等蛋白表达的增强，不仅可以增强细胞自身的侵袭性生长，并可以诱导细胞基质的广泛破坏，二者之间可以相互作用，共同促进肿瘤细胞恶性生物学行为[6]。该实验研究也同样证明了这一点。
其他学者通过免疫组化等方法证实：nm23-H2与同家族的nm23-H1不同，其关键点在于：nm23-H2可通过结合C-myc基因启动子中的NHE III1区域的G4序列，从而激活C-myc[7-8]。通过后者进一步完成相应的生物学作用。该实验中，将不同浓度的nm23-H2抗体与C6细胞共培养，研究在Rho-GTPases/nm23通路中，nm23-H2所能发挥的作用。该研究证实，nm23-H2抗体通过对nm23-H2的抑制，可以在一定程度上，降低MMP-2蛋白的表达及磷酸化程度，表明nm23-H2与MMP-2蛋白之间必然存在某种联系，说明二者很有可能在上游蛋白水平存在调控机制，基因水平的调控及转录后的修饰过程中可能存在影响，有待我们后期进一步研究。
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参考文献
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（收稿日期：2014-08-26）