林清强，石颖岚，李 琼，蔡 钒，王正朝
（福建师范大学 生命科学学院，福建 福州 350108）
摘 要：本研究从红色诺卡氏菌细胞壁骨架中分离出具有免疫活性的多糖成分.用盐酸断裂多糖和粘肽之间的化学键后用乙醇从细胞壁骨架中将多糖沉淀出来，利用苯酚-硫酸法测定酸解后的多糖含量，结果表明提取率为5.12 %.通过Sephadex G-100（1.7cm×20.5cm）凝胶柱层析用pH=7.0，Tris-HCl,洗脱速度为1.0mL/min进行分离纯化，出现8个洗脱峰.洗脱峰的具体成分，有待于进一步测定.
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关键词 ：红色诺卡氏菌；细胞壁骨架；多糖；分离纯化
中图分类号：Q539文献标识码：A文章编号：1673-260X（2015）08-0017-03
基金项目：福建省教育厅项目(JB12029)
红色诺卡氏菌(Nocardia rubra)是一种放线菌，是目前所发现具有最强细胞毒活性和免疫促进作用的一种微生物.因为一方面红色诺卡氏菌具有最强细胞毒活性，说明这种微生物对肿瘤细胞有最强的毒性，可以直接杀灭肿瘤细胞；另一方面具有免疫促进作用，说明这种微生物可以调节并增强机体的免疫力.研究表明[1]:红色诺卡氏菌细胞壁骨架（以下简称N—CWS）,在增强体内巨噬细胞、T细胞和自然杀伤细胞的活性的同时，还能诱导机体产生LAK细胞等,产生抗癌作用,有效地抑制肿瘤生长.所以N-CWS已经成为治疗肿瘤的有效制剂.它具有提高机体内T辅助性细胞和杀伤细胞的功能,增强巨噬细胞和自然杀伤细胞的免疫活性，抑制肿瘤和增强免疫能力的功效.其主要有效成分为[2]霉菌酸，阿拉伯半乳糖，粘肽.由于N-CWS的组成复杂，使用过程仍然存在一定的副作用,其起主要作用的物质不明确，影响了后续对其作用机制和药用开发.而有关N-CWS的多糖成分分离纯化的报道较少，本文研究了N-CWS的多糖成分的提取及分离纯化，为进一步分析该产品中多糖的成分和结构提供参考,为新药的开发与制备提供基础数据.
1 材料与方法
1.1 实验材料及仪器
1.1.1 主要材料和试剂:
红色诺卡氏菌(由本实验自行培养传代提供)；Sephadex G-100（为Pharmacia公司产品）；葡萄糖(广东汕头西陇化工厂产品，AR);苯酚(广东汕头西陇化工厂产品，AR);硫酸(广东汕头西陇化工厂产品，AR);阿拉伯糖(广东汕头西陇化工厂产品，AR);其他生化试剂均为分析纯.
1.1.2 主要仪器
可见分光光度计（V-1100型，上海美谱达仪器有限公司）；电子天平（AL104，梅特勒-托利多仪器有限公司）；电热恒温振荡水槽；微量离心机（TG16-W型）；电热鼓风干燥箱（101-2型，上海阳光实验仪器有限公司）；BT1-100恒流泵（上海琪特分析器有限公司）；BSZ-100A自动部分收集器（上海琪特分析器有限公司）；凝胶层析柱（1.7㎝×20.5㎝为Pharmacia公司产品）；TGL-16M高速台式冷冻离心机.
1.2 实验方法
1.2.1 红色诺卡氏菌细胞壁骨架的制备
红色诺卡氏菌经菌体培养,菌体破碎，蛋白酶处理，脱色及有机溶媒处理后即可获得白色的红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂[3].
1.2.2 多糖PS的提取
800ugN-CWS样品加入0.1mol/L HCl溶液酸解[4]，放于60℃的电热箱内孵育12h.16000r/min离心15min 后收集上清液并浓缩，加3倍体积的无水乙醇，混匀后静置过夜使多糖充分沉淀，离心收集PS沉淀.
1.2.3 标准曲线的制备[5]
准确称取标准阿拉伯糖50mg于500mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度.分别吸取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL阿拉伯糖溶液，各以水补至2.0mL，然后加入6%的苯酚溶液1.0mL，再加入浓硫酸5.0mL，迅速震荡摇匀，置于25℃水浴30min，取出于490nm测光密度值，以2.0mL蒸馏水为空白对照，以阿拉伯糖微克数为横座标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线.
1.2.4 样品溶液的制备和含糖量的测定
将样品加水至1.0mL,用移液器吸取样品液100μL并补水至2.0mL，然后加入6%的苯酚溶液1.0mL，再加入浓硫酸5.0mL，迅速震荡摇匀，置于25℃水浴30min，取出用V-1100型分光光度计于490nm测光密度值，以标准曲线计算其多糖含量.多糖得率计算：多糖得率=(多糖质量／样品质量)X100％.
1.2.5 Sephadex G-100凝胶柱层析
装柱:称取5克Sephadex G-100,加入50ml去离子水，浸泡溶胀过夜.[6]将悬浮细颗粒,随上层液体倾去之后,加入等体积的1.0mol/LNaOH浸泡并间歇搅拌2h倾去,用蒸馏水洗涤至中性,用1.0mol／L HCl溶液浸泡1h，用蒸馏水洗至中性，再用1.0mol／L NaOH溶液浸泡2h.最后用蒸馏水洗至pH中性，备用.采用上述处理过的Sephadex G-100凝胶装柱.装柱过程需将凝胶缓慢加入,不能出现断层,纹路和气泡,必须均匀,否则要重新装柱.柱装好后用3-5倍体积的缓冲液平衡层析柱,保持流速1.0ml/ min,直至流出液与上柱缓冲液完全相同.
上样:用移液器取样品280μL,用玻棒引流沿管壁缓缓加入到凝胶床面上.样品全部加入后，加入0.05mol/L pH=7.0 Tris-HCl洗脱液,小心清洗凝胶床界面表面，使黏附着的样品全部洗入凝胶床,直到液面高出凝胶床面2-3cm.
洗脱:用0.05 mol/L pH=7.0 Tris-HCl缓冲液洗脱，调节好恒流泵的流速1.0ml/min，开始收集.每1min管收集1管，收集120管.用苯酚-硫酸法进行跟踪测定多糖,以洗脱管数为横坐标，吸光值为纵坐标绘制洗脱曲线作图.
2 结果与分析
2.1 样品PS含量测定
2.1.1 标准曲线的制备
以苯酚-硫酸[7]为显色剂，用比色法测定多糖含量.多糖类成分在浓硫酸作用下，先水解成单糖，单糖迅速脱水生成糠醛衍生物，糠醛与苯酚直接结合生成橙红色衍生物，该衍生物在490nm处出现最大吸收值，记录数据如表1，其吸收值与糖质量浓度呈线性关系.绘制标准曲线如图1，样品测定以标准曲线，计算多糖含量.
2.1.2 样品的测定
取多糖样品800ug，精密称定，置1mL离心管中，加水稀释至刻度，摇匀.提取前和提取后各精密量取样品溶液100μL，照标准曲线制备项下的方法，制备样品供试液.以阿拉伯糖为标准,用苯酚-硫酸法,在490nm波长处测定OD值,以标准曲线计算其多糖总含量.结果见表2,结果样品中多糖得率以阿拉伯糖含量计算.根据标准曲线如图1，计算样品多糖含量.为了消除单糖对测定的影响，本法在测定之前先用无水乙醇进行沉淀处理，实验表明，根据标准曲线,求出总糖量为16.15%.用盐酸解离后经沉淀处理后，提取的多糖含量5.12%.结果如表2,表明还有大部分多糖还未被盐酸解离，提取出来的多糖占总糖的31.7%.
2.2 Sephadex G-100凝胶柱层析分离
将提取的粗多糖溶液Sephadex G-100凝胶柱层析，上样体积为280μL，洗脱曲线如图2所示.从图2可以看出.粗多糖经凝胶柱层析洗脱可以得到8个峰.结果发现经Sephadex G一100的洗脱曲线峰太多，而且峰较密集，说明样品中粗多糖成分复杂.因此洗脱柱填充材料和洗脱条件有待进一步研究.
从洗脱曲线上看，从10管到18管中出现的三个洗脱峰都比较密集说明有可能是分子量相近的多糖,35到38管出现两个相连的洗脱峰分离效果较差表明这也是相似的多糖成分.从图2来看，提取出来多糖的成分较为复杂，除了主要的阿拉伯糖和半乳糖之外还有其他的多糖.影响洗脱效果的因素主要有：凝胶孔径，洗脱速度，洗脱浓度，柱长等.由于乙醇沉淀下来的多糖样品一般含有少量的肽聚糖，类脂，蛋白质等杂质.总之用Sephdex G-100纯化的效果不是十分明显，为了能够对其生物学活性和作用机制进行后续研究,对该样品进行纯度鉴定，分子量测定和组分分析等实验.
3 讨论
3.1 苯酚硫酸法测定
关于苯酚-硫酸法测定多糖含量原理是多糖在浓硫酸的作用下，先水解为单糖，迅速脱水形成糠醛衍生物，然后与苯酚缩合为有色化合物，在490nm处有特征吸收值.
根据已有文献的报道[8-10],该实验方法有所差异，主要区别在于是否加热，关键操作为硫酸的添加方式，应将浓硫酸垂直加入试管中，而不应沿管壁加入，否则将会造成一定的误差.因为反应所需的温度可以通过快速加入浓硫酸产生热量达到,从而使多糖显色充分.采用苯酚-硫酸法测定多糖含量时，不同单糖显色产物之间的最大吸收波长与吸收值有所不同.因此，选择合适物质配制标准曲线也是实验的关键.在现有的文献报道中，该多糖的测定均以葡萄糖为标准.而结构分析表明N-CWS多糖的主要组成单糖是阿拉伯糖和半乳糖[5].阿拉伯糖和葡萄糖与N-CWS多糖的苯酚-硫酸法显色产物的吸收光谱特征相比较，表明N－CWS多糖的吸收光谱与阿拉伯糖基本一致，而与葡萄糖有所差异.因此，实验采用阿拉伯糖配制标准溶液测定N-CWS多糖，测定结果能比葡萄糖更准确地反映其含量.
3.2 N-CWS中PS的提取方法
根据已有的文献关于N-CWS中PS提取的报道较少,除了用盐酸浸提多糖，酸解样品使多糖和类脂，肽聚糖，脂肪酸，蛋白质等物质的化学键断裂，还可以使用甲酰胺和容菌酶将细胞壁中的多糖解离出来，但是后两者反应激烈会将多糖水解成单糖，影响多糖生物学活性的后续研究.经过本实验，表明用盐酸浸提的方法简单方便，对多糖的化学键没有造成断裂，保持其生物学性质以便进一步研究分析作用机制.
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