杜娜 陈倩 李洋 肖婧珊 姚梦姣 李亚
（曲阜师范大学生命科学学院，山东 曲阜 273165）
【摘要】目的：探讨中药复方枳菊解郁汤对抑郁模型小鼠空间学习记忆能力的影响及其机制。方法：采用多种因素慢性轻度不可预见性应激方式建立抑郁模型小鼠，分别给予小鼠低、中、高剂量枳菊解郁汤处理。采用Morris水迷宫实验，检测小鼠的空间学习记忆能力的变化；通过免疫组织化学方法检测脑内基质细胞衍生因子（SDF-1）的表达。结果：与对照组相比，模型组小鼠的空间学习记忆能力明显下降（P<0.01），SDF-1在海马CA1，CA3，DG及前脑皮层的表达明显降低(P<0.05)；与模型组相比，枳菊解郁汤中剂量组小鼠的空间学习记忆能力明显增高（P<0.05），SDF-1在海马CA1，CA3，DG及前脑皮层的表达明显增加（P<0.05）。结论：枳菊解郁汤的抗抑郁作用可能与SDF-1的表达上调有关。
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关键词 中药复方；慢性应激；抑郁症；SDF-1；学习记忆；海马；前脑皮层
Effects of Chinese Medical Prescription on Spatial Learning-Memory and Expression of SDF-1 in Brain of Depression Model Mice
DU Na CHEN Qian LI Yang XIAO Jing-shan YAO Meng-jiao LI Ya
（College of Life Science, Qufu Normal University, Qufu Shandong 273165, China）
【Abstract】Objective：To explore the effects of Chinese Medical prescription of Zhijujieyu-tang on the ability of spatial learning-memory in depression model mice brain and its mechanism. Method：Using depression model mice induced by multivariate chronic unpredictable stressors, and give the animal different doses of Zhijujieyu-tang. The ability of spatial learning-memory of mice were determined by Morris Water Maze, and the expression of stromal cell-derived factor-1(SDF-1) in the brain were detected by immunohistochemical method. Result：Compared with the control group mice, the spatial learning- memory in model group mice were significantly decreased (P<0. 01). The SDF-1 expression in the CA1, CA3, DG regions of hippocampus (HP) and prefrontal cortex (PFC) were significantly reduced in the model group mice (P<0. 05). Compared with the model group mice, Zhijujieyu-tang medium dosage can improve the learning and memory function, and the expression of SDF-1 in HP and PFC (P<0. 05). Conclusion：Zhijujieyu-tang antidepressant-like property may be closely related to the up-regulation of SDF-1expression in HP and PFC.
【Key words】Chinese Medicine; Chronic stress; Depression; Learning-memory; SDF-1; HP; PFC
抑郁症（depression）是一类严重威胁人类身体健康的常见精神卫生疾病[1]，可以造成身体器官的功能紊乱，其程度可以从轻度的忧伤到重度的绝望、自杀企图等。抑郁症发病机制复杂，病程长，易复发。对于抑郁症的治疗，西药的疗效较有限，易产生耐药性和不良反应明显等缺点，而中药复方具有多成分、多环节、多靶点的特点，辨证施治；同时，国内外在抗抑郁药物的研制与开发方面逐渐重视传统药物和天然药物[2]。基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）在神经元发育过程中有重要作用，可影响海马神经元突起延伸和凋亡效应[3]，对神经干细胞的迁移、轴突分支及神经细胞损伤修复有重要作用[4]。本研究通过多因素慢性轻度不可预见性应激方式建立抑郁小鼠模型，检测小鼠空间学习记忆能力的变化，并通过免疫组织化学方法检测海马及前脑内SDF-1的表达。探讨中药复方枳菊解郁汤对抑郁模型小鼠空间学习记忆能力的影响及其机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
昆明品系小白鼠，体重18-21g，2月龄，雌雄各半，由济宁鲁抗药业实验动物中心提供。实验小鼠分笼饲养，每日按灌胃手法抓取抚摸，使小鼠适应1周。
1.2 实验药物
中药复方枳菊解郁汤配方：石菖蒲15g、枳实10g、夜交藤20g、菊花15g、炒枣仁30g、勾藤30g、郁金15g、柏仁30g、胆星10g，由曲阜市中医医院提供。用量：按人鼠等效剂量（生药量175g）换算为低剂量，其二倍量为中剂量，四倍量为髙剂量。每日一次灌胃给药，每鼠每天0.2 ml。阳性药物对照组采用盐酸氟西汀胶囊，20mg/粒，由常州华生制药有限公司提供，国药准字：H19980138。用量：按人鼠等效剂量换算，3.6mg/kg.d，溶于0.2ml蒸馏水中，每日一次灌胃给药，每鼠每天0.2 ml。
1.3 动物分组
小鼠适应一周后随机分组：对照组，模型组，氟西汀组，中药低、中、高剂量组。每组12只。对照组和模型组小鼠每天蒸馏水灌胃；氟西汀组小鼠每天氟西汀灌胃；中药低、中、高剂量组，根据各自的剂量，每只小鼠每天中药灌胃给药。各组小鼠应激前1h灌胃给药。
1.4 慢性应激抑郁模型的建立
除对照组外，各组小鼠均接受7种不同应激方式，包括电击足底（每隔1分钟每次持续10秒刺激，电压38V，共计15次）、冷水刺激（8℃冷水，共计3min）、斜笼(24h)、禁食（24h）、禁水（24h）、通宵照明、高台（1h，高台直径10cm、高160cm）。每天选取一种应激方式，随机选择，持续应激21天。对照组小鼠正常饲养，不给予任何应激。
1.5 Morris水迷宫实验
Morris水迷宫视频跟踪分析系统由圆形水池、平台、视频跟踪设施、分析软件4部分组成。水池内分为4个象限。平台放置在第一象限（目标象限），在对面象限（第三象限）做好明显标记物。平台在水面以下约1 cm。水温控制在25oC。定位航行实验共进行4天，每天每只小鼠共接受4次找平台训练。每只小鼠依次从四个象限的入水点入水池，记录小鼠从入水至爬上平台的逃避潜伏期(escape latency)，检测小鼠的空间学习能力。空间搜索实验在实验第5天进行，平台撤除，小鼠从第三象限入水点入水，记录小鼠120s内在各个象限的游泳（停留）时间，检测小鼠的记忆保持能力。
1.6 小鼠海马和前脑皮层SDF-1的表达
水迷宫实验后立即进行灌流取脑，用戊巴比妥钠对小鼠进行腹腔麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，经左心室快速灌注37℃生理盐水和预冷4%多聚甲醛磷酸盐（PFA）缓冲液，开颅取脑，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，行冠状切片（5μm）。按照SDF-1免疫组化试剂盒说明(武汉博士德生物工程有限公司提供)进行免疫组织化学染色。选取每只小鼠海马CA1、CA3、齿状回(DG)和前脑皮层(PFC)切片3 张，每个玻片各随机取两个视野，用Motic Images Advanced 3.2 图像处理系统检测SDF-1阳性细胞平均目标灰度值。
1.7 统计学分析方法
实验数据采用平均数±标准误（M±SE）表示。定位航行实验的逃避潜伏期采用重复测量的方差分析(Repeated-measures ANOVA)；其它数据均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间比较用N-K法，以P<0.05表示有统计学显著性差异。
2 结果
2.1 各组小鼠空间学习记忆能力的变化
定位航行实验结果显示（表1），对照组和模型组小鼠的逃避潜伏期迅速降低（P<0.01）；氟西汀组、枳菊解郁汤低、中、高剂量组小鼠的逃避潜伏期均明显减少(P<0.001, P<0.01)。表明各组小鼠随着训练周期的增加，空间学习能力得到提高。与对照组小鼠相比，模型组小鼠4天的逃避潜伏期均显著增多(P<0.01, P<0.05)；与模型组小鼠相比，氟西汀组和枳菊解郁汤中剂量组小鼠4天的逃避潜伏期均显著减少（P<0.01），高、低剂量组小鼠在第4天出现显著减少（P<0.05）。表明模型组小鼠的空间学习能力减弱，而枳菊解郁汤能改善抑郁小鼠的空间学习能力，且中剂量效果更好。
表1 各组小鼠的逃避潜伏期 (秒，M±SE)
*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较；+P<0.05，++P<0.01，与模型组比较；n=12.
空间搜索实验结果显示（表2）：对照组小鼠在第一象限（平台所在象限）停留时间明显高于其他象限（P<0.01）；而模型组小鼠在第一象限停留时间明显低于第二、三象限停留时间（P<0.001）。与对照组小鼠相比，模型组小鼠的第一象限停留时间明显减少（P<0.01）；与模型组小鼠相比，氟西汀组小鼠、枳菊解郁汤低、中、高剂量组均显著增加（P<0.01, P<0.05）。表明抑郁模型小鼠空间记忆能力减弱；枳菊解郁汤能改善抑郁模型小鼠空间记忆，且中剂量效果最明显。
表2 各组小鼠在四个象限的停留时间 (秒，M±SE)
*P<0.05，与对照组比较；+P<0.05，++P<0.01，与模型组比较； n=12.
2.2 各组小鼠海马和前脑皮层SDF-1的表达
各组小鼠免疫组化结果显示（表3）：SDF-1在海马各区及前脑皮层均有不同程度的表达，与对照组相比，模型组小鼠CA1、CA3、DG和前脑皮层SDF-1的平均目标灰度值明显增高（P<0.01），模型组SDF-1的表达减弱；与模型组相比，氟西汀组、中药各剂量组SDF-1的平均目标灰度值均不同程度降低(P<0.01, P<0.05)，SDF-1的表达增强。
3 讨论
有研究报道，慢性、低强度、长期的日常压力是引发抑郁症的主要原因[5]，慢性应激抑郁动物模型被广泛应用于抑郁症的研究。英国心理学家Morris创建了水迷宫实验以评估动物的空间学习记忆能力，Morris水迷宫实验模型已经成为研究学习记忆的常用方法之一。定位航行实验是动物通过空间视觉线索找到隐匿平台，从水中逃生的程序，用于动物空间学习能力的检测；空间探索实验则用于评价动物空间记忆能力。本研究显示，模型组小鼠的逃避潜伏期均显著增多，空间搜索实验中在第一象限停留时间也明显减少，表明抑郁模型小鼠的空间学习和记忆能力均减弱；氟西汀组、枳菊解郁汤中剂量组的逃避潜伏期均减少，空间搜索实验的第一象限停留时间均明显增多，表明枳菊解郁汤能有效改善抑郁模型小鼠空间学习、记忆能力减退的现象，从而起到一定的抗抑郁效果。
慢性应激导致神经化学方面的改变可能参与了抑郁症的发生，尤其是神经内分泌、神经递质、神经可塑性的改变在抑郁症的发生中起到重要作用。研究发现慢性应激动物脑区海马及前脑皮层的整体形态发生改变[6]，从而导致神经细胞受到损害。我们先前的研究表明，多因素慢性应激可引起小鼠脑内神经元的损伤[7]。SDF-1是一种表达于多种细胞和组织的基质细胞衍生因子[4]，在胚胎发育、肿瘤转移、免疫系统、循环系统及中枢神经系统的发育和修复中起着重要作用，可影响海马神经元突起延伸、凋亡效应及神经干细胞的迁移。本研究结果显示，SDF-1在海马各区及前脑皮层均有不同程度的表达，模型组小鼠CA1、CA3、DG和前脑皮层SDF-1的平均目标灰度值明显增高；氟西汀组、中药各剂量组SDF-1的平均目标灰度值均不同程度降低，且中剂量有显著差异，表明枳菊解郁汤通过上调抑郁模型小鼠SDF-1在脑区的表达，对损伤的神经元进行修复，进而起到一定的抗抑郁作用。
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参考文献
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［3］Liu SF，Xing M，Han XF，et al. Effects of SDF-1α on neurite outgrowth and apoptosis of hippocampal cells[J]. Chinese J Neuroanatomy, 2011, 27: 611-616.
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［5］Alberts SC, Sapolsky RM, Altmann J. Behavioral, endocrine, and immunological correlates of immigration by an aggressive male into a natural primate group[J]. Horm. & Behav., 1992, 26: 167-178.
［6］张艳美.慢性应激、大脑损伤与抑郁症[J].国外医学精神病学分册,2001,28:105-109.
［7］史建勋,张冠雄,赵海杰,等.枳菊解郁汤对抑郁模型小鼠空间学习记忆能力及脑内bFGF的影响[J].信息科技,2012,33:53-54.
［责任编辑：杨玉洁］