高效液相色谱法测定复方莲草颗粒中槲皮素的含量
马敬仪邱野董金香
(长春中医药大学，吉林 长春 130117)
【摘要】目的：建立复方莲草颗粒中槲皮素的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱（HPLC）法，色谱柱为Diamonsil C18（4.6mm×250mm,5μm），甲醇-0.4%磷酸(50：50)为流动相；流速为1ml/min；检测波长为366nm；柱温为30℃。结果：槲皮素在0.1004μg-1.004μg范围内与峰面积呈良好线性关系Y=27878x-4733.6,r=0.9999，平均加样回收率为99.84%，RSD=2.72%。结论：该法简便、准确、可靠，可作为复方莲草颗粒的质量控制指标之一。
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关键词 白花蛇舌草；槲皮素；含量测定；高效液相色谱法
原发性支气管肺癌是起源于支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤[1]。目前研究认为肺癌的发生与正气虚弱、脏腑功能失调有关。莲草颗粒为多年临床经验方，由白花蛇舌草、半枝莲、人参等三味中药组成，共奏清热解毒，利水消肿，固本益气之功效。主要用于肺癌的辅助治疗。白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草 Hedyotis diffusa Willd. 的干燥全草，广泛分布于亚热带地区，我国的广西、福建、湖南、安徽、云南等地均有生长[2]。主要含有多糖、黄酮和蒽醌类等成分[3]。具有清热解毒，消痈散结，利尿消肿、抗菌消炎、抗肿瘤、调节免疫功能等功效[4-5]。本文采用高效液相色谱(HPLC) 法测定白花蛇舌草的槲皮素含量，为其质量控制标准提供了研究数据。
1材料与方法
1.1仪器与药品
岛津LC-10AT型高效液相色谱仪，EL-204型电子分析天平，TP-150 超声波清洗机。实验所用到的药材饮片全部从长春市宏检药材公司购买，经过鉴定全部符合药典标准；槲皮素（C15H10O7）由中国药品生物制品检定所提供（批号：100081-200907）；甲醇为色谱纯（美国Fisher公司），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
1.2制备工艺
莲草颗粒由白花蛇舌草、半枝莲等几味中药组成。取上述几味中药，加8倍量水，煎煮2次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.05～1.10（40～50℃），以8000r/min离心20min，取上清液，减压干燥，粉碎。干法制粒送料变频10，压力变频20，制粒变频15，制成颗粒1000g，即得。
1.3色谱条件
色谱柱为Diamonsil C18（4.6mm×250mm,5μm），甲醇-0.4％磷酸(50：50)为流动相；检测波长为366nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量为10μl。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。
1.4溶液的制备
1.4.1对照品溶液
取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.05mg/ml的溶液，即得对照品溶液。结果见图1。
1.4.2供试品溶液
取本品粉末（过三号筛）1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml,密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率33kHz）20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml,置100ml锥形瓶中，加甲醇10ml、25％盐酸溶液5mL，摇匀，置水浴中加热回流30min,迅速冷却至室温转移至50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图2。
按莲草颗粒处方比例，取白花蛇舌草以外的药材，依照工艺流程项下方法制得阴性样品。按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。结果见图3。
1.4.3阴性样品溶液
2结果与分析
2.1线性关系试验
分别精密吸取槲皮素对照品溶液2μl、5μl、10μl、13μl、15μl、20μl，依“1.3”色谱条件进样，测定峰面积。以槲皮素进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为：Y=27878x-4733.6，r=0.9999。槲皮素在 0.1004μg~1.004μg范围内，与峰面积呈良好的线性关系。
2.2精密度试验
取槲皮素对照品溶液，连续进样6次，进样量为10μl，测定其峰面积。计算相对标准偏差RSD=0.33%,表明进样方法和仪器精密度良好。
2.3稳定性试验
取槲皮素对照品溶液和供试品溶液，分别于2、4、6、8、10、12小时进样，进样量10μl，槲皮素对照品和供试品溶液RSD值分别为1.72%和1.94%，二者在12h内稳定性较好。
2.4重现性试验
精密称取同一批样品6份，按“1.4.2”配制供试品溶液进行测定，计算槲皮素含量，RSD=2.1608%，符合要求。
2.5加样回收率
精密称取6份与重现性试验同批次的样品0.5g，分别精密加入适量的槲皮素对照品溶液，依法测定，计算其加样回收率，结果见表1。
由上表数据可知，莲草颗粒的平均回收率是99.84%，其RSD值为2.72%，均符合药典标准。
2.6含量测定
测定三批样品中槲皮素的含量，平均含量为3.9447mg/g，将此含量下浮20%为制剂的含量测定限度，即本品每克中以槲皮素(C15H10O7)计不得少于0.32mg。
3讨论
本实验用高效液相色谱法对君药白花蛇舌草中的主要成分槲皮素含量进行了测定，方法操作简单、快速，其精密度、重复性、稳定性、回收率均符合要求，适用于复方莲草颗粒的质量控制。暂定本品每克含白花蛇舌草以槲皮素计，按三批成品平均含量的80%计算不得低于0.32mg。
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参考文献
［1］葛均波,徐永健.内科学[M].北京:人民卫生出版社,2013:75.
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［3］陈永康.白花蛇舌草的化学成分研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(17):290-292.
［4］Sadava D, Ahn J, Zhan M, et al. Effects of four Chinese herbal extracts on drug-sensitive and multidrug-resistant small-cell lung carcinoma cells[J].Cancer Chemother Pharmacol, 2002,49(4):261.
［5］单保恩,张金艳,杜肖娜,等．白花蛇舌草的免疫学调节活性和抗肿瘤活性[J]．中国中西医结合杂志,2001,21(5):370-374．
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