丁丽艳
作者简介：丁丽艳（1971-），女，研究员，硕士研究生，主要研究方向是牛的繁殖和遗传育种。
（黑龙江省畜牧研究所胚胎工程重点实验室 161005）
摘要：牛体外受精技术是胚胎生物工程技术研究的基础，其中牛卵丘卵母细胞体外成熟培养是体外受精技术的关键，也是重要环节。自上世纪三十年代以来，国内外研究者们都付出了大量的研究工作，并取得了较大研究进展。目前，牛卵丘卵母细胞体外成熟培养体系已经确立，但其中的卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育阻滞，卵母细胞的成熟调控机理等问题，还有待研究者们进一步深入探讨。本文主要从牛卵丘卵母细胞的获得方法、体外培养条件、体外培养液及添加物、存在问题等几方面来综述其研究进展。
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关键词 ：牛；卵丘卵母细胞；体外培养
牛卵丘母细胞体外成熟是在牛体外模拟卵泡环境，进而诱发未成熟卵母细胞成熟的一项生物技术。其是牛体外受精（IVF）的基础，也是重要环节之一，牛卵丘卵母细胞的体外成熟质量直接影响其体外受精效果，甚至是影响出生牛犊的质量。本文就牛卵丘卵母细胞体外成熟研究现状、研究方法、体外成熟的判定和存在问题等进行论述。
1研究现状
有关专家于1935年利用兔卵泡中分离出来的卵丘卵母细胞进行体外培养，经成功减数分裂后，完成了兔卵丘卵母细胞的体外成熟过程。此后，哺乳动物的卵丘卵母细胞体外成熟培养技术得到了迅猛发展。目前，卵丘卵母细胞的体外成熟技术已被广泛应用于科学研究、医学生殖工程和畜牧生产中。牛未成熟卵母细胞经体外培养，体外成熟率可达90%以上。然而，体外成熟卵母细胞的质量和发育潜能与体内成熟的卵母细胞相比仍有较大差距，体外成熟的卵母细胞存在细胞质成熟差或者细胞核和细胞质成熟并不同步等问题。针对目前牛体外受精研究中出现的问题，有关专家认为，牛卵丘卵母细胞在成熟过程中退化以及细胞质不完全成熟是造成其体外受精胚胎生产效率低的主要原因。
2研究方法及进展
2.1牛卵丘卵母细胞的获得
2.1.1从废弃的牛卵巢中获得
即运用切割法或抽吸法等机械分离法从屠宰场废弃的牛卵巢上获取未成熟的卵母细胞。将收集卵巢置于25～35℃的生理盐水中，添加抗生素，3小时内运回实验室。将术者的手和母牛的卵巢消毒后，将卵巢上多余的肉割掉，用装有18号针头的5毫升注射器，从卵巢表面直径为2～6毫米卵泡中抽取卵母细胞，也可用消毒的手术刀片切割卵巢，回收卵母细胞。
此方法中卵巢保存温度对卵母细胞的质量影响较大，此方法获得的卵母细胞成本低，但由于淘汰的牛大多无系谱，难以做到良种化。
2.1.2应用牛活体采卵技术采集卵丘卵母细胞
牛活体采卵技术是继牛体外受精、胚胎移植（ET）技术之后研究并推出的又一项胚胎工程技术。牛的活体采卵技术于90年代后期开始研究，2001年，活体采卵、体外受精的牛胚胎移植后成功获得犊牛出生。此项新技术与IVF及ET技术的配套综合利用，将更充分地挖掘优良母牛的遗传潜力，缩短牛的世代间隔，扩大遗传背景清楚、价格低廉的胚胎来源，从而加速养牛业的遗传改良。同时，也可为牛的基因工程研究提供大量的试验材料，以促进动物基因工程研究迅速发展。
2.2活体采卵的方法
活体采卵的方法主要有盲采法、内窥镜法和超声波法。
盲采法完全依赖操作者的经验进行，采集结果不稳定，回收率低，且对卵巢和阴道组织损伤比较大，延长了采卵间隔，降低了采卵频率，因此限制了该技术的应用。
内窥镜法可直观、准确地对卵泡进行穿刺，对卵巢损伤很小，但对阴道穹隆损伤比较大，且设备复杂，操作繁琐。
超声波法借助B超采集卵母细胞，是最主要的活体卵方法之一。
3牛卵丘卵母细胞体外成熟培养
牛卵丘卵母细胞的体外成熟首次由某位外国研究者完成， 但这仅限于核的成熟。牛卵丘卵母细胞体外成熟的胚胎发育潜能直到1978 年才通过体内受精获得犊牛证实。1986年，有关专家报道了牛卵母细胞经体外成熟及体外受精获得的试管犊牛，进一步确证了体外成熟牛卵母细胞的可行性。
3.1成熟培养液
目前，用于牛卵丘卵母细胞体外成熟的基础培养液多为TCM199，也有的使用Ham’s F?10， MEM， TALP等培养液。
3.2培养液中的添加物
3.2.1血清
血清中含有蛋白质、维生素、脂肪、激素、氨基酸等营养物质和多肽类因子，是卵丘卵母细胞体外成熟与受精所必需的物质，能有效提高牛卵丘卵母细胞的体外成熟率。随着研究的深入，人们了解到血清除了可以提供卵巢上卵泡体外生长所必需的营养物质以外，也存在抑制卵泡生长的因素。因此，近年来研究用牛血清白蛋白或白蛋白来代替血清添加到基础培养液中，起到很好的培养效果。
3.2.2激素
目前，绝大多数研究者在牛卵丘卵母细胞的体外成熟培养中添加促性腺激素或类固醇激素或两者的混合物，结果都对卵母细胞成熟起到了促进作用。培养液中添加激素能够刺激腔前卵泡的生长及腔的形成，并且抑制颗粒细胞的凋亡，而在无激素的培养液中卵母细胞成熟率显著降低，且退化量大大增加。
3.2.3生长因子
基础培养基中添加各种生长因子和细胞因子，如胰岛素、表皮生长因子 、胰岛素生长因子 、白血病抑制因子 、转化生长因子 等，对卵母细胞的生长、成熟可起到重要的调节作用。生产因子是卵母细胞成熟的诱导剂，能促进牛卵丘卵母细胞的体外成熟。
3.2.4卵泡液
卵泡液能够提高成熟卵母细胞质的质量，同时，控制卵泡液在培养液中的添加浓度，可以消除其对核成熟的抑制作用。有研究表明，卵泡液对核成熟的抑制作用与所采卵泡的大小有关。来自小卵泡（ 小于3毫米） 和中卵泡（3～8毫米） 的卵泡液抑制卵母细胞核成熟，大卵泡液（大于8毫米） 对核成熟没有抑制作用。
3.2.5卵丘细胞
卵丘细胞能够增加卵母细胞内谷胱甘肽（ GSH）含量，GSH具有促进精子穿卵、雄原核形成及提高组蛋白H1活性等功能。在卵丘细胞与卵母细胞之间存在间隙连接，一些小分子物质如离子、核酸、氨基酸等可在两者之间交换，进而促进卵母细胞成熟，卵丘细胞能促进卵母细胞体外减数分裂的恢复，并且对发生GVBD后至排出PB1也起着重要作用。
3.2.6钙离子
细胞内Ca2+可以使无活性的促进因子，处于激活状态，进而促进卵母细胞的成熟分裂。
3.3培养条件
3.3.1气相条件
体外培养一般采用含5%CO2的空气，或5%CO2、5%O2、90%N2的气体。培养系统内CO2不仅可以平衡培养基，而且还有助于细胞代谢中的丙酮酸转换成草酰乙酸，有利于细胞成熟。
3.3.2温度条件
不同的温度对卵母细胞体外成熟的影响很大，过高或过低的温度均不利于卵母细胞的体外成熟。牛卵母细胞一般采用39℃进行体外培养。
3.3.3湿度
对于湿度的调节，一般需在CO2 培养箱内放置调湿盘，以维持99%～100%的相对湿度，防止因培养液蒸发改变培养基成分的浓度，影响pH值和渗透压。
4牛卵丘卵母细胞体外成熟的判定
牛卵丘卵母细胞的成熟是涉及细胞核、细胞质、膜、卵丘细胞和透明带等成熟的复杂生物学过程。在形态上表现为纺锤体形成，核仁致密化，染色质高度浓缩形成染色体，第一极体释放，细胞器重组，以及卵丘细胞扩展、膨胀、液化和透明带软化等。近年来研究者借助光镜和电镜逐渐揭示出这一生理生化过程的形态结构变化。由于仅有核成熟和卵丘细胞成熟能在光镜下进行判定，而对卵母细胞的综合成熟过程很难做一整体的具有生理学意义的评价，因而现在主要是以卵丘细胞扩散，并释放出第一极体作为卵母细胞体外培养成熟的判定标准。
5存在问题与展望
经过人们大量研究与探讨，牛卵丘卵母细胞的体外成熟技术逐渐被掌握，并得到了不断提高，同时也存在诸多问题，如卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育阻滞，体外成熟卵母细胞的受精率较低，卵母细胞的成熟调控机理还不完全清楚等，但是，相信随着研究的不断深入，存在的问题会逐步被解决，同时，随着牛卵母细胞体外成熟技术的不断发展和完善，其必将推动牛体外受精技术的深入发展，并且，进一步促进核移植、外源基因导入和胚胎干细胞的研究，为促使牛胚胎操作技术的深入和牛体外受精胚胎商业化的普及，提供更有利研究和应用手段。