刘琪，董美玲，张红，孔亮，李伟
（大连海洋大学，辽宁 大连 116023）
摘要：采用中性蛋白酶对海马粉进行酶解获得酶解液，并对酶解液的抗氧化活性、抑菌活性和抗疲劳活性进行了测定。实验结果表明，海马酶解液对DPPH的清除率为：雄海马45.2%，雌海马36%；清除羟自由基率为：雄海马81.7%，雌海马80.0%；超氧阴离子清除率为：雄海马46.0%，雌海马34.4%。海马酶解液同时具有抑菌活性，通过滤纸片法可以看出海马酶解液对大肠杆菌、产气杆菌和变形杆菌的抑制性比较强，而对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑制性较弱。海马酶解液还具有抗疲劳活性，通过小鼠负重游泳实验检测海马中性蛋白酶酶解液的抗疲劳活性，实验组游泳时间平均为143 min，而对照组的游泳时间为91 min，相比之下实验组比对照组高出52 min。进一步的研究结果还表明，海马酶解液具有增加小鼠游泳耐力、增加小鼠血清中SOD活力、降低血清中MDA和尿素以及降低血乳酸的作用。
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关键词 ：海马；中性蛋白酶；抗氧化活性；抑菌活性；抗疲劳活性
利用海洋生物资源进行药物开发的系统研究始于20世纪60年代。70-80年代开始了大规模筛选，并发现了多种有生物活性的化合物，到20世纪90年代，则有多个海洋生物新药进入临床实验。海马（Hippocampus）作为刺鱼目海龙科动物，还是一种具有较高经济价值的名贵中药，具有强身健体、补肾壮阳、舒筋活络、消炎止痛、镇静安神、止咳平喘等药用功能，在中药经典著作中均有记载，欧洲从18世纪就已经开始将海马入药。海马中含有丰富的氨基酸、蛋白质、微量元素及高碳多烯不饱和脂肪酸；具有抗癌作用、性激素样作用、抗疲劳作用和提高机体免疫力、提高心肌细胞的收缩功能等，有待在食品、医药等方面进行研究开发[1]。
目前，市场上有许多关于海马壮阳功效的产品，如泌阳春海马胶囊，实验表明具有明显提高机体性功能的药理作用[1]。但是关于海马的抗氧化活性和抗疲劳活性报道的较少，报道较多的是海马的性激素样作用，例如用5种海马的乙醇提取物，研究表明，灌服5种海马的乙醇提取物后，雄性小鼠的精子数和精子成活率增加，但对正常小鼠的性腺和性器官几乎无影响。
本实验先利用中性蛋白酶对海马进行酶解，对海马酶解液进行抗氧化活性、抑菌活性和抗疲劳活性分别进行了测定。
1实验部分
1.1仪器与试剂
1.1.1试剂与材料海马（克氏海马）为雌、雄海马，均购自大连美罗大药房；硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、氢氧化钠、硼酸溶液、冰醋酸均为分析纯；中性蛋白酶（250 g，Beijing Solarbio）；乙腈（色谱纯，百灵威科技有限公司)； N,N-二甲基甲酰胺（分析纯，天津博迪化工股份有限公司）。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus），变形杆菌（Bacterium Proteus），枯草杆菌（Bacillus Subtilis），大肠杆菌(Escherichia coli)，产气杆菌(clostridium perfingens)均来自大连海洋大学食品工程学院微生物实验室；超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（生产批号20130406）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（生产批号20130406）、尿素氮（BUN）测定试剂盒（生产批号20130410）、乳酸（LD）测定试剂盒（生产批号20130417） 购于南京建成生物研究所。DPPH，浓H2SO4，Tris-HCl缓冲溶液，95%乙醇，水杨酸，盐酸，邻苯三酚，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，中性蛋白酶，胰蛋白酶酶解，牛肉膏，琼脂，无水乙醇，氯化钠，葡萄糖，盐酸，氢氧化钠等均为分析纯，20只昆明小鼠（清洁级，大连医科大学提供），PBS缓冲液，鼠粮，木屑，铅丝。缓冲溶液和实验室用水均用Milli-Q净化处理器制备。
1.1.2仪器与设备Milli-Q超纯水净化仪（Millipore公司，美国）。高速多功能粉碎机（上海冰都有限公司）。Pb-10型pH计（德国赛得利斯Sartorius）。TGL-16M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。消化炉（Buchi Digestion Unit K-424），蒸馏仪（Buchi Distillation Unit K-350）。SP-752紫外分光光度计（上海光谱有限公司），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），YXQ-SG42-280手提式压力蒸汽灭菌锅，超净工作台（SW-CJ-1F），电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）。
1.2海马样品的制备及溶液配制方法
将海马雌雄分开，剪碎，用高速粉碎机将其粉碎，得到雌雄海马粉末样品，碎屑，称重，将其装入棕色广口瓶中，备用。
准确称取0.500 0 g的海马粉末，加入配制好的磷酸盐缓冲溶液100 mL，加入一定量的酶，在水浴锅里反应一定时间，反应完后放入100 ℃的水浴锅中灭酶10 min，等冷却到室温后将酶解液过0.45 μm滤膜过滤，4 ℃冰箱中保存，作为样品储备液备用。
1.3海马中蛋白质以及灰分含量的测定
1.3.1海马中蛋白质含量的测定将海马样品进行消化：将样品进行分组，雄海马粉末，雄海马碎屑，雌海马粉末，雌海马碎屑。分别准确称取海马样品0.500 0 g，小心移入干燥洁净的500 mL消化管，然后加入研细的硫酸铜0.500 0 g，硫酸钾10.000 0 g和浓硫酸20 mL，空白组除了不加样品外其他和实验组一样，轻轻摇匀后放入电路中加热，至液体变为蓝绿色透明后停止。
样品的蒸馏与滴定：分别将消化完全的消化液冷却后，完全转入100 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。准确移取消化稀释液10 mL于蒸馏仪内的消化管中，再加入10 mL，400 g/L氢氧化钠溶液使其呈强碱性。蒸馏仪中的冷凝管下端预先插入盛有10 mL，40 g/L硼酸吸收液的液面下，吸收液中带有混合指示剂，蒸馏5 min后停止。馏出液用0.1 mol/L HCl标准溶液滴定至微红色为终点。同时做空白试验。
结果计算：海马种中蛋白质的含量按下式计算：
式中： c——HCl标准溶液的浓度，mol/L；
V1——滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；
V2——滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；
m——样品质量，g；
M——0.5N2摩尔质量，14.01g/moL；
F——氮换算为蛋白质的系数（F=6.25）。
1.3.2海马中灰分含量的测定分别准确称取雄海马粉末、碎屑各1 g，雌海马粉末、碎屑各1 g于已知质量的坩埚中，经预处理后的海马置于调温电炉上以小火加热使试样充分碳化至无烟为止。将碳化好装有试样的坩埚用坩埚钳移至高温炉中，在（550±25）℃下灼烧4 h，待高温炉炉温降至200 ℃以下后取出坩埚，冷却至室温。
结果计算：海马中灰分的含量按下式计算：
灰分
式中：X——样品中总灰分的含量；
m1——空坩埚的质量，g；
m2——样品加空坩埚的质量，g；
m3——残灰加空坩埚的质量，g。
1.4海马酶解液的活性研究
1.4.1海马酶解液抗氧化活性的研究海马酶解液清除DPPH的能力：准确量取2 mL海马酶解液，然后加入2 mL所配制的DPPH溶液并混合均匀后，25 ℃水浴反应30 min，移入比色皿中517 nm测其吸光度Ai，同时测定2 mL样液加入2 mL乙醇25 ℃水浴反应30 min后的吸光度Aj，2 mL的DPPH加2 mL的乙醇25 ℃反应30 min的吸光度A0。则海马酶解液的DPPH清除率按下式计算：
式中：Ai——样品加入DPPH后溶液的吸光度。
Aj——样品加入乙醇后溶液的吸光度。
Ao——空白溶液的吸光度。
海马酶解液清除羟自由基的能力：准确量取海马酶解液2 mL，然后加入3 mmol/L的FeSO4 2 mL，6 mmol/L的水杨酸－乙醇2 mL，最后加入质量分数为3.75%的双氧水2 mL启动反应，在37 ℃反应30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm下测吸光度，考虑到样本本身的吸光度Ai，取蒸馏水2 mL，3 mmol/L的FeSO4 2 mL，6 mmol/L的水杨酸－乙醇2 mL和样液2 mL作为本底吸收Aj, 取蒸馏水2 mL，3 mmol/L的FeSO4 2 mL，6 mmol/L的水杨酸－乙醇2 mL，最后加入质量分数为3.75%的双氧水2 mL启动反应，37 ℃反应30 min的吸光度A0。则海马酶解液对羟基自由基的清除率按下式计算：
式中：Ai——样品中加入FeSO4，水杨酸－乙醇和双氧水后溶液的吸光度。
Aj——样品中加入FeSO4，水杨酸－乙醇后溶液的吸光度，即本底吸收。
Ao——不加样品，空白溶液的吸光度。
海马酶解液清除超氧离子自由基的能力：取海马酶解液1 mL加入pH为8.2，0.05 mol/L的tris-HCl缓冲溶液4.5 mL，在25 ℃水浴中保温20 min后，加入0.5 mL 25 mmol/L邻苯三酚，混匀后，在25 ℃中保温5 min，用1 mL 8 mmol/L的HCl终止反应。以蒸馏水作为空白对照为A0，在320 nm下测吸光度值Ai，考虑到样本本身的吸光度，加入0.05 mol/L的tris-HCl缓冲溶液4.5 mL，在25 ℃水浴中保温20 min后，加入0.5 mL的水，混匀后，在25 ℃中保温5 min，用1 mL 8 mmol/L的HCl终止反应，在320 nm下测吸光度值Aj。则海马酶解液对超氧阴离子自由基的清除率按下式计算：
式中：Ai——样品加入tris-HCl缓冲溶液，邻苯三酚和HCl后溶液的吸光度。
Aj——样品加入tris-HCl缓冲溶液，HCl后溶液的吸光度，即本底吸收。
Ao——不加样品，空白溶液的吸光度。
1.4.2海马酶解液的抑菌活性
培养基的制作：取牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，水1 L，调pH值到7.0～7.2之间，加热融化，然后在121 ℃灭菌20 min后备用。
菌悬液的配制：从经过活化的菌体斜面上挑取一环菌体接种于相应的液体培养基上，放入恒温震荡培养箱中培养至对数生长期，分别吸取各供试液0.5 mL，加入无菌水稀释，备用。
平涂法接种：在无菌操作台里，将融化好的培养基均匀的倒在平板上，等培养基冷却好后，在培养皿的底部用记号笔划出均匀的区域，点燃酒精灯，将三角玻璃棒进行灭菌，在将酒精灯旁分别用移液枪取出100 μL的五种菌悬液，用三角玻璃棒将菌悬液均匀的涂布在培养基上。
滤纸片法测海马酶解液的抑菌活性：经平涂接种发后，当培养基上的菌悬液完全渗透到培养基上时，用无菌镊子将小滤纸片轻轻的贴在平板上，滤纸片一旦贴上就不可拿起，然后取酶解液样品和75%乙醇（作为阳性对照）各10 μL滴在滤纸片上，每个平板贴6张滤纸片，一张为空白对照，每张滤纸片的间距不得少于24 mm。待干后将放有样品的培养皿倒过来放在恒温培养箱里培养24 h后观察抑菌圈的大小。
1.4.3海马酶解液的抗疲劳活性实验动物的饲养与给药：昆明种小鼠20只，体重18～22 g。随机分为两组，分组后饲养观察3 d，剔除不合格个体后按小鼠体重平均分为两组给药，空白对照组灌胃PBS缓冲液0.2 mL/d，阳性对照组灌胃中性蛋白酶的海马酶解液0.2 mL/d。连续灌胃15 d，实验期间小鼠自由摄食饮水。
酶解液对小鼠游泳时间的影响以及体内指标的变化：给药第15 d后，末次灌胃半小时后进行负重游泳实验。小鼠负重为小鼠体重5%的铅丝，将两组小鼠分别放入两个水温（25±1） ℃、水深40 cm的水槽中同时游泳，记录小鼠从入水至运动疲劳发生时的游泳时间。以小鼠头部没入水面以下7 s不再上浮判定为疲劳。
1.4.3.1小鼠血清SOD和MDA的测定小鼠连续灌胃15 d，在末次灌胃30 min后，小鼠自由游泳5 min后取出，断头取血。血样置冰箱静置后，3 500 r/min离心10 min，取上清液，分别按照SOD测定试剂盒MDA测定试剂盒说明书方法测定实验组和对照组血清中SOD和MDA含量。
1.4.3.2小鼠肌乳酸、血清尿素含量的计算取断头取血的血样，3 500 r/min离心10 min，取上清液，按照LD测定试剂盒说明书方法测定LD。按照BUN测定试剂盒说明书方法测定断头取血所得的血清中BUN含量。
2结果与讨论
2.1海马中蛋白质含量测定
海马中蛋白质含量测定结果见表1，由结果可以看出雄海马粉末蛋白质含量为55.83%，雌海马粉末的蛋白质含量为49.00%。蛋白质在人体含量的多少决定了物质营养价值的高低的重要指标，从表中可以看出海马蛋白质含量高达52?42%，但是本实验采用的蛋白质含量的测定方法为凯氏定氮法，属于元素分析的范畴，因此，从测定结果看蛋白质含量较高，但是考虑到海马体内还含有其他的含氮生物分子，该结果只是作为随后的氨基酸分析的依据。
2.2海马中灰分含量测定
海马中灰分含量测定结果见表2。结果表明，雌雄海马的灰分分别为12.3%，12.6%。雌雄海马的灰分含量相差不大，雌雄海马灰分的平均含量为12.45%。
2.3海马中性蛋白酶酶解液的活性研究
2.3.1海马酶解液抗氧化活性
2.3.1.1海马酶解液对DPPH的清除率从表3可以看出海马酶解液对DPPH有一定的清除能力，其清除能力与多肽和水解的氨基酸有关。其中，雄海马的中性蛋白酶酶解液对DPPH的平均清除率为45.2%；雌海马的中性蛋白酶酶解液对DPPH的平均清除率为36.0%。
2.3.1.2海马酶解液对羟基自由基的清除率通过表4可以看出海马酶解液对·OH有显著的清除效果。其中，雄海马的中性蛋白酶酶解液对·OH的清除率为81.7%；雌海马的中性蛋白酶酶解液对·OH的清除率为80.03%；可以看出，雄海马酶解液对·OH的清除率要好于雌海马酶解液。
2.3.1.3海马酶解液对超氧阴离子自由基的清除率通过表5可以看出，海马酶解对O2-有一定的清除能力。其中，雄海马的中性蛋白酶酶解液对O2-的清除率为46.0%；雌海马的中性蛋白酶酶解液对O2-的清除率为34.4%。通过比较表3-12两组数据可以看出，雄海马酶解液对O2-的清除率要高于雌海马酶解液。
2.3.2抑菌活性实验结果通过表6的数据可以看出，海马酶解液对大肠杆菌、产气杆菌和变形杆菌的抑制性比较强，而对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑制性不是很强。其中对变形杆菌抑制作用最强的是雄海马的中性蛋白酶酶解液；对枯草杆菌抑制作用最强的是雄海马的中性蛋白酶酶解液；对产气杆菌的抑制，雌雄海马的中性蛋白酶酶解液作用强度基本相同；对大肠杆菌的抑制作用最强的是雄海马的中性蛋白酶酶解液；但是每一种样品都不可能对所有菌种均有抑制作用，整体来看海马中性蛋白酶酶解液有一定的抑菌活性，可以用于进一步的研究。
从上面四组表格可以看出这样一个共性：雄海马的抗氧化活性和抑菌活性均优于雌海马，原因可能是雄海马有育儿的义务，体内的优质蛋白要高与雌海马。这与前面测得的雄海马的蛋白质含量高于雌海马的结果是一致的。
2.3.3抗疲劳活性实验结果灌服海马酶解液对小鼠游泳时间的影响见表7，可以看出，连续灌服海马酶解液15 d对小鼠的体重略有变化，但是不是很显著。从表中可以看出，灌服海马酶解液的实验组小鼠的游泳时间达到143 min，极显著高与对照组93 min。小鼠游泳时间的延长，表明海马酶解液能延缓运动性疲劳出现的时间。但是仅凭运动时间还不足以说明海马酶解液具有运动性抗疲劳的作用，还需要一些生化指标来说明。
2.3.3.1海马酶解液对小鼠血清SOD、MDA的影响总超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）是一种新型的酶制剂，广泛存在于需氧原核生物和真核生物中，能够清除体内的活性氧自由基。在机体代谢过程中会产生大量的活性氧和自由基，它可攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。如醛基、酮基、羟基以及新的氧自由基等。可见超氧化物歧化酶对机体起到保护免受损伤的作用。同时可测定丙二醛（Maleic Dialdehyde，MDA）的含量以此来反映机体脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。实验结果见表8。
从表8的数据可知，实验组小鼠血清中SOD活力比对照组高了13.5%。实验组小鼠血清中MDA含量比对照组降低了42.53%。运动可以引起脂质过氧化反应从而产生自由基，自由基对肌肉细胞造成损害，从而产生疲劳。SOD酶能清除超氧阴离子自由基（O2-·），保护细胞免受损伤，因此能够降低疲劳的程度。灌服海马酶解液的小鼠血清中SOD含量明显增加，因此有助于减少自由基的堆积，延缓疲劳。MDA是脂质自由基氧化产物之一，它的高低间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。灌服海马酶解液的小鼠血清中MDA含量的减少，也表明海马酶解液有助于降低自由基氧化过程，抵抗机体的疲劳。因此，灌服海马酶解液的小鼠延缓了疲劳的出现。
2.3.3.2海马酶解液对小鼠肌乳酸含量及血清尿素的影响尿素是人体内蛋白代谢的主要终产物，它构成了血液中绝大部分的非蛋白氮。血中尿素氮来源于肝脏，通过肾脏随尿液排除体外。肾脏功能衰竭、肾炎、泌尿道梗阻等可使血液尿素氮含量升高。而乳酸含量越多，疲劳程度越重[2]。结果见表9。
从表9的数据可知，实验组小鼠乳酸含量比对照组降低4.8%。实验组小鼠血清尿素含量比对照组降低3.0%。动物剧烈运动后，无氧糖酵解过程产生的乳酸堆积，是产生疲劳的一个重要原因。灌服海马酶解液的实验组乳酸堆积程度小于对照组，提示海马酶解液具有加速乳酸清除代谢的作用。血清中尿素含量随着运动负荷的增加而增加，机体对负荷适应能力越强，血清中尿素含量就越少。实验结果表明，灌服海马酶解液的实验组血清中尿素含量低于对照组，表明海马酶解液在一定程度上可以提高小鼠运动负荷能力，抵抗疲劳。
3结论
海马的粉末经过中性蛋白酶酶解后含有丰富的多肽和氨基酸，这些多肽和氨基酸具有抗氧化活性。实验证明海马酶解液对DPPH的清除率为：雄海马45.2%，雌海马36%；清除羟自由基率为：雄海马81.7%，雌海马80.0%；超氧阴离子清除率为：雄海马46.0%，雌海马34.4%。海马酶解液同时具有抑菌活性。通过滤纸片法可以看出海马酶解液对大肠杆菌，产气杆菌和变形杆菌的抑制性比较强，而对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑制性不是很强。海马酶解液还具有抗疲劳活性。通过小鼠负重游泳实验检测海马中性蛋白酶酶解液的抗疲劳活性，实验组游泳时间平均为143 min，而对照组的游泳时间为91 min，相比之下实验组比对照组高出52 min。研究结果还表明了海马酶解液具有增加小鼠游泳耐力、增加小鼠血清中SOD活力、降低血清中MDA和尿素以及降低血乳酸的作用。实验结果表明，海马可作为海洋药物开发的潜在优质原料。
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参考文献：
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（收稿日期：2015-05-14）