马瑞欣1，2，周凡1，2，郝新丽1，2，王国辉1，2
（1.河北省水产养殖病害防治监测总站，河北石家庄050011；
2.河北省水产品质量检验检测站，河北石家庄050011；）
基金项目：河北省现代农业产业体系特色海产品创新团队资助。
作者简介：马瑞欣（1973.4-），女，工程师，疫病防控与质量安全岗位团队成员。maruixin2003@126.com
DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2015.03.019
摘要：建立了水产品中土霉素、四环素、金霉素的快速提取方法。样品用甲醇＋水＋甲酸＝80＋20＋0.3的溶液和0.3%甲酸的甲醇溶液两步提取，减压蒸去甲醇，定容后高效液相色谱分析。土霉素回收率在75.90%～116.2%之间，四环素回收率在67.87%～102.2%之间，金霉素回收率在43.78%～84.17%之间，RSD<15%。土霉素和四环素检出限0.1mg/kg，金霉素检出限0.2mg/kg。
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关键词 ：高效液相色谱法（HPLC）；水产品；土霉素；四环素；金霉素
四环素类药物属广谱抗生素，具有良好的杀菌和抗菌作用，水产养殖中常用于防治水生动物的细菌性疾病，但这些药物会在水生动物体内残留，从而对人类的健康产生有害影响。目前检测水产品中四环素类药物残留的方法有液相色谱法[1-2]、液质联用法[3]等。这些方法采用高氯酸溶液或缓冲溶液提取，经固相萃取柱净化，浓缩后进行仪器分析，前处理步骤繁琐，所用试剂耗材较多，且提取液浑浊，造成固相萃取净化困难，从而延长了前处理时间。本文建立了一种检测水产品中四环素类药物残留量的前处理方法，步骤简单，所用试剂耗材少，前处理时间短，可用于水产品中土霉素、四环素、金霉素的快速筛选。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
HPLC1100配有紫外检测器（Agilenttechnologies）；漩涡振荡器（IKA，MS3）；离心机（湖南湘仪，TDZ5-WS）；高速离心机（上海安亭，TGL-16C）；多样品平行蒸发仪（syncore，BUCHI）；超纯水仪（MILLI-Q，millipore）；十万分之一电子天平（赛多利斯，CPA225D）；百分之一电子天平（赛多利斯，TE212-L）。
土霉素、四环素、金霉素均购自德国Dr.Ehrenstorfer；甲醇、正己烷为色谱纯，甲酸、磷酸二氢钠、磷酸、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）均为分析纯。
0.01mol/L磷酸二氢钠溶液的配制：称取1?56g磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O），溶于超纯水中，定容至1000mL，用磷酸调pH＝2.5，过0.45μm滤膜备用。
实验用水为超纯水。
储备液的配制：分别准确称取按其纯度折算为100%质量的土霉素、四环素、金霉素各10?0mg，分别用甲醇溶解并定容至100mL，三种储备液的浓度均为100μg/mL，-18℃避光保存。
标准曲线的配制：取上述贮备液用0.3%甲酸水溶液稀释成土霉素、四环素含量为0.050、0?100、0.200、0.500、1.000、2.000μg/mL，金霉素含量为0.100、0.200、0.400、1.000、2.000、4?000μg/mL的混合标准溶液。
1.2色谱条件
色谱柱：ZORBAXEclipseXDB-C18柱（4?6mm×250mm，粒度5μm）；流动相：乙腈＋0.01mol/L磷酸二氢钠溶液（pH＝2.5）＝20＋80；流速0.8mL/min；紫外检测波长355nm；柱温：37℃；进样量：20μL。
1.3实验方法
1.3.1样品制备鱼取脊背肉，切成小块，虾、蟹取可食部分，海参去除内脏，切成小块，分别绞碎混匀成肉糜，放入干净密闭的容器内，-18℃以下保存。
1.3.2样品前处理称取样品5.00g于50mL塑料离心试管中，加入10mL甲醇＋水＋甲酸＝80＋20＋0.3混合溶液，3000r/min涡旋振荡2min，4000r/min离心5min，上清液倒入50mL试管中。在样品中再加入15mL0.3%甲酸的甲醇溶液，3000r/min涡旋振荡2min，4000r/min离心5min，合并上清液。在上清液中加入正己烷15mL，涡旋振荡1min，静止分层，弃去上层，再加入15mL正己烷去脂1次，下层溶液减压蒸去甲醇，用0.3%甲酸水溶液定容至5mL，加入5mL正己烷离心去脂，取1.5mL下层溶液10000r/min离心5min，过0.45μm滤膜，高效液相色谱分析。
2结果与讨论
2.1回收率和精密度
分别称取草鱼、对虾、梭子蟹、海参四种空白样品，进行标准物质添加后混合均匀。除0.100mg/kg添加样品-20℃存放24h外，其他添加样品均在-20℃存放72～96h后取出，室温下解冻后进行实验。土霉素回收率在75.90%～116.2%之间，四环素回收率在67.87%～102?2%之间，金霉素回收率在43.78%～84.17%之间，RSD<15%。四种水产品不同添加量下的回收率和精密度见表1，空白样品和加标样品色谱图见图1。三种药物中，土霉素的回收率较好，四环素次之，金霉素较差。实验发现浓缩过程中金霉素存在一定程度的降解，这可能是导致其回收率低的原因之一。
图1空白样品和加标样品色谱图（添加量：土霉素、四环素1.00mg/kg，金霉素2.00mg/kg）
2.2线性和检出限
土霉素、四环素线性范围为：0.050～2.00mg/L，金霉素线性范围为：0.100～4.00mg/L；R≥0.995；土霉素和四环素检出限0.1mg/kg，金霉素检出限为0.2mg/kg。标准物质溶液色谱图见图2。梭子蟹、海参含水量较高，提取液蒸去甲醇后有少部分水剩余，故定容体积为5mL。若样品含水量低，可减小定量体积，从而提高检出限。金霉素的响应信号较低，也是导致其检出限低于土霉素和四环素的原因之一。
2.3提取溶剂的确定
实验选用了不同的提取溶剂提取草鱼、对虾、梭子蟹、海参中的四环素类药物残留，样品进行了标准物质添加：土霉素和四环素添加量为2.00mg/kg；金霉素添加量为4.00mg/kg。各种提取剂的提取效果见表2。实验发现使用甲醇提取时，三种药物的回收率除对虾外均低于40%；加入氨水，溶液呈碱性，金霉素均未检出，土霉素和四环素的回收率很低；加甲酸后三种药物的回收率明显增加；实验比较了4%和0.3%的甲酸甲醇溶液的提取结果，无较大区别。但使用甲醇+甲酸提取时，除海参外，其他三种水产品的四环素和金霉素回收率基本在40%～60%之间。在提取液中加入适量水后，四环素和金霉素提取效率提高，土霉素提取效率略显下降，但随着提取液中水含量增高，溶液的浑浊度和粘稠性会增加，蒸去甲醇后剩余溶液的体积增大，检出限降低。综合考虑检出限和提取效率，故提取溶剂确定为：先用10mL甲醇+水+甲酸=80+20+0.3混合溶液提取，再用15mL0.3%甲酸的甲醇溶液提取。
图2标准物质溶液色谱图（土霉素、四环素浓度为0.100mg/L，金霉素浓度为0.200mg/L）
由于四环素类药物易与金属离子形成螯合物，实验还比较了乙二胺四乙酸二钠对回收率的影响，样品中先加入0.1g乙二胺四乙酸二钠，再加入提取液提取，未发现乙二胺四乙酸二钠对三种药物回收率的影响。
2.4不同基质对三种药物回收率的影响
根据水产品的成分不同、含水量不同，考虑到不同基质对回收率的影响，本文选用草鱼、对虾、梭子蟹、海参四个品种进行实验。结果显示：三种药物中，土霉素和四环素的回收率受基质影响较小；金霉素回收率受基质的影响较明显，其中海参的金霉素回收率较高，位于64%~84%之间，其他三种产品的金霉素回收率较低，位于43.78%~72.42%之间。
3结论
本方法前处理简单，土霉素、四环素的检出限能够满足NY5070-2002《无公害食品水产品中渔药残留限量》100μg/kg的要求，可用于水产品中土霉素、四环素的快速筛选；不足之处是金霉素的回收率和检出限有待于进一步提高。
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参考文献：
[1]
SC/T3015-2002，水产品中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定[S].北京：中国标准出版社，2003
[2]高效液相色谱-荧光法测定水产品中多种四环素残留[J].渔业科学进展，2012，33(5)：102-108.
[3]GB/T21317-2007，动物源食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法[S].北京：中国标准出版社，2008
（收稿日期：2015-01-23；修回日期：2015-02-05）