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高效液相色谱法检测水产品中的四环素类药物残留

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  • 更新时间2015-09-15
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马瑞欣1,2,周凡1,2,郝新丽1,2,王国辉1,2

(1.河北省水产养殖病害防治监测总站,河北石家庄050011;

2.河北省水产品质量检验检测站,河北石家庄050011;)

基金项目:河北省现代农业产业体系特色海产品创新团队资助。

作者简介:马瑞欣(1973.4-),女,工程师,疫病防控与质量安全岗位团队成员。maruixin2003@126.com

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2015.03.019

摘要:建立了水产品中土霉素、四环素、金霉素的快速提取方法。样品用甲醇+水+甲酸=80+20+0.3的溶液和0.3%甲酸的甲醇溶液两步提取,减压蒸去甲醇,定容后高效液相色谱分析。土霉素回收率在75.90%~116.2%之间,四环素回收率在67.87%~102.2%之间,金霉素回收率在43.78%~84.17%之间,RSD<15%。土霉素和四环素检出限0.1mg/kg,金霉素检出限0.2mg/kg。

教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 :高效液相色谱法(HPLC);水产品;土霉素;四环素;金霉素

四环素类药物属广谱抗生素,具有良好的杀菌和抗菌作用,水产养殖中常用于防治水生动物的细菌性疾病,但这些药物会在水生动物体内残留,从而对人类的健康产生有害影响。目前检测水产品中四环素类药物残留的方法有液相色谱法[1-2]、液质联用法[3]等。这些方法采用高氯酸溶液或缓冲溶液提取,经固相萃取柱净化,浓缩后进行仪器分析,前处理步骤繁琐,所用试剂耗材较多,且提取液浑浊,造成固相萃取净化困难,从而延长了前处理时间。本文建立了一种检测水产品中四环素类药物残留量的前处理方法,步骤简单,所用试剂耗材少,前处理时间短,可用于水产品中土霉素、四环素、金霉素的快速筛选。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

HPLC1100配有紫外检测器(Agilenttechnologies);漩涡振荡器(IKA,MS3);离心机(湖南湘仪,TDZ5-WS);高速离心机(上海安亭,TGL-16C);多样品平行蒸发仪(syncore,BUCHI);超纯水仪(MILLI-Q,millipore);十万分之一电子天平(赛多利斯,CPA225D);百分之一电子天平(赛多利斯,TE212-L)。

土霉素、四环素、金霉素均购自德国Dr.Ehrenstorfer;甲醇、正己烷为色谱纯,甲酸、磷酸二氢钠、磷酸、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)均为分析纯。

0.01mol/L磷酸二氢钠溶液的配制:称取1?56g磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),溶于超纯水中,定容至1000mL,用磷酸调pH=2.5,过0.45μm滤膜备用。

实验用水为超纯水。

储备液的配制:分别准确称取按其纯度折算为100%质量的土霉素、四环素、金霉素各10?0mg,分别用甲醇溶解并定容至100mL,三种储备液的浓度均为100μg/mL,-18℃避光保存。

标准曲线的配制:取上述贮备液用0.3%甲酸水溶液稀释成土霉素、四环素含量为0.050、0?100、0.200、0.500、1.000、2.000μg/mL,金霉素含量为0.100、0.200、0.400、1.000、2.000、4?000μg/mL的混合标准溶液。

1.2色谱条件

色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C18柱(4?6mm×250mm,粒度5μm);流动相:乙腈+0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(pH=2.5)=20+80;流速0.8mL/min;紫外检测波长355nm;柱温:37℃;进样量:20μL。

1.3实验方法

1.3.1样品制备鱼取脊背肉,切成小块,虾、蟹取可食部分,海参去除内脏,切成小块,分别绞碎混匀成肉糜,放入干净密闭的容器内,-18℃以下保存。

1.3.2样品前处理称取样品5.00g于50mL塑料离心试管中,加入10mL甲醇+水+甲酸=80+20+0.3混合溶液,3000r/min涡旋振荡2min,4000r/min离心5min,上清液倒入50mL试管中。在样品中再加入15mL0.3%甲酸的甲醇溶液,3000r/min涡旋振荡2min,4000r/min离心5min,合并上清液。在上清液中加入正己烷15mL,涡旋振荡1min,静止分层,弃去上层,再加入15mL正己烷去脂1次,下层溶液减压蒸去甲醇,用0.3%甲酸水溶液定容至5mL,加入5mL正己烷离心去脂,取1.5mL下层溶液10000r/min离心5min,过0.45μm滤膜,高效液相色谱分析。

2结果与讨论

2.1回收率和精密度

分别称取草鱼、对虾、梭子蟹、海参四种空白样品,进行标准物质添加后混合均匀。除0.100mg/kg添加样品-20℃存放24h外,其他添加样品均在-20℃存放72~96h后取出,室温下解冻后进行实验。土霉素回收率在75.90%~116.2%之间,四环素回收率在67.87%~102?2%之间,金霉素回收率在43.78%~84.17%之间,RSD<15%。四种水产品不同添加量下的回收率和精密度见表1,空白样品和加标样品色谱图见图1。三种药物中,土霉素的回收率较好,四环素次之,金霉素较差。实验发现浓缩过程中金霉素存在一定程度的降解,这可能是导致其回收率低的原因之一。

图1空白样品和加标样品色谱图(添加量:土霉素、四环素1.00mg/kg,金霉素2.00mg/kg)

2.2线性和检出限

土霉素、四环素线性范围为:0.050~2.00mg/L,金霉素线性范围为:0.100~4.00mg/L;R≥0.995;土霉素和四环素检出限0.1mg/kg,金霉素检出限为0.2mg/kg。标准物质溶液色谱图见图2。梭子蟹、海参含水量较高,提取液蒸去甲醇后有少部分水剩余,故定容体积为5mL。若样品含水量低,可减小定量体积,从而提高检出限。金霉素的响应信号较低,也是导致其检出限低于土霉素和四环素的原因之一。

2.3提取溶剂的确定

实验选用了不同的提取溶剂提取草鱼、对虾、梭子蟹、海参中的四环素类药物残留,样品进行了标准物质添加:土霉素和四环素添加量为2.00mg/kg;金霉素添加量为4.00mg/kg。各种提取剂的提取效果见表2。实验发现使用甲醇提取时,三种药物的回收率除对虾外均低于40%;加入氨水,溶液呈碱性,金霉素均未检出,土霉素和四环素的回收率很低;加甲酸后三种药物的回收率明显增加;实验比较了4%和0.3%的甲酸甲醇溶液的提取结果,无较大区别。但使用甲醇+甲酸提取时,除海参外,其他三种水产品的四环素和金霉素回收率基本在40%~60%之间。在提取液中加入适量水后,四环素和金霉素提取效率提高,土霉素提取效率略显下降,但随着提取液中水含量增高,溶液的浑浊度和粘稠性会增加,蒸去甲醇后剩余溶液的体积增大,检出限降低。综合考虑检出限和提取效率,故提取溶剂确定为:先用10mL甲醇+水+甲酸=80+20+0.3混合溶液提取,再用15mL0.3%甲酸的甲醇溶液提取。

图2标准物质溶液色谱图(土霉素、四环素浓度为0.100mg/L,金霉素浓度为0.200mg/L)

由于四环素类药物易与金属离子形成螯合物,实验还比较了乙二胺四乙酸二钠对回收率的影响,样品中先加入0.1g乙二胺四乙酸二钠,再加入提取液提取,未发现乙二胺四乙酸二钠对三种药物回收率的影响。

2.4不同基质对三种药物回收率的影响

根据水产品的成分不同、含水量不同,考虑到不同基质对回收率的影响,本文选用草鱼、对虾、梭子蟹、海参四个品种进行实验。结果显示:三种药物中,土霉素和四环素的回收率受基质影响较小;金霉素回收率受基质的影响较明显,其中海参的金霉素回收率较高,位于64%~84%之间,其他三种产品的金霉素回收率较低,位于43.78%~72.42%之间。

3结论

本方法前处理简单,土霉素、四环素的检出限能够满足NY5070-2002《无公害食品水产品中渔药残留限量》100μg/kg的要求,可用于水产品中土霉素、四环素的快速筛选;不足之处是金霉素的回收率和检出限有待于进一步提高。

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参考文献:

[1]

SC/T3015-2002,水产品中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定[S].北京:中国标准出版社,2003

[2]高效液相色谱-荧光法测定水产品中多种四环素残留[J].渔业科学进展,2012,33(5):102-108.

[3]GB/T21317-2007,动物源食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法[S].北京:中国标准出版社,2008

(收稿日期:2015-01-23;修回日期:2015-02-05)