翟兴月1，侯秀秀2，佟长青2，杜影3，李伟2
（1.大连医科大学附属第二医院临床营养科，辽宁大连116023；
基金项目：海洋局公益性行业科研专项（项目编号201205022-7）。
作者简介：翟兴月（1982-），女，主治医师，研究方向为食品营养。
通讯作者：佟长青，男，副教授，E-mail：changqingtong@dlou.edu.cn；李伟（1964-），男，教授，Tel：0411-84763553；E-mail：aisingioro@hotmail.com。
DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2015.07.006
2.大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连116023；3.大连市疾病预防控制中心，辽宁大连116021）
摘要：采用硅胶柱色谱及薄层制备色谱等手段从真海鞘（HalocynthiaroretziDrasche）壳中分离纯化出了3种化合物。对所获得的化合物经过理化性质、波谱分析和文献对照的方法进行了结构鉴定。同时，采用CCK-8方法对75%EtOH浸提所获得的真海鞘壳浸膏进行了抑制人肝癌细胞HepG2生长测试。结果表明，从真海鞘壳中分离得到3种化合物分别为：Diethyl24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate（化合物1）、胆甾醇（化合物2）和6-（2，，3，-Dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol（化合物3）。体外测试表明，75%EtOH浸提所获得的真海鞘壳浸膏具有显著抑制人肝癌细胞HepG2生长的活性，可作为潜在的抗肿瘤药物进行进一步研究。
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关键词 ：真海鞘；化学成分；结构鉴定；人肝癌细胞HepG2
真海鞘（HalocynthiaroretziDrasche）主要分布于日本的海男鹿半岛以北的海域及韩国的东海岸和南海岸[1]。真海鞘可食部分含有丰富的营养成分，味道鲜美，深受人们的欢迎。李春艳等研究了真海鞘的营养价值，发现其可食部分除了含有丰富的氨基酸及矿物质以外，还含有丰富的必需不饱和脂肪酸[2]。近年来，辽宁和山东进行了真海鞘的引进和养殖，目前已经形成一定的规模化养殖[3]。真海鞘体外是呈橙红色具有很多乳头状突起的被囊（壳），是不可食部分，目前大多被当成废物废弃[1]。
）海洋生物生活环境与陆生生物的生活环境不同。海洋生物生活环境往往更加极端，如高盐、高压环境，它们为了适应这样的生活环境，往往产生一些特殊结构的代谢中间产物。海洋生物所含有的特殊结构的代谢中间产物往往又成为潜在的药源生物活性物质。对真海鞘壳化学成分的研究未见报道。本研究中，对真海鞘壳化学成分分离及其浸膏抗肿瘤活性进行了研究，旨在为真海鞘壳的开发利用提供基础数据。
1材料和方法
1.1材料
）真海鞘（HalocynthiaroretziDrasche）2013年10月于山东省威海市荣成寻山集团采购；人肝癌细胞HepG2来自中国科学院上海细胞库；D101大孔吸附树脂柱购于天津市海光化工有限公司；硅胶（20～300mesh，10～40μm）及薄层层析硅胶（SilicagelforThin-layerChromatography，HG/T2354-92）购于青岛海洋化工有限公司；SephadexLH-20葡聚糖凝胶购于Sigma公司；CCK-8检测试剂盒（Dojindo，CK04）来自株式会社同仁化学研究所；其他试剂为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1真海鞘壳浸膏的制备真海鞘壳（湿重21kg）洗去泥沙，剪成约2cm×2cm的小块，置于圆底烧瓶中，加入3倍量的75%EtOH，加热回流提取2h，提取3次，制成浸膏并称重，放入冰箱中冷冻保藏备用。
依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对提取到的浸膏进行3次萃取，浓缩，分别得到石油醚萃取部分（9g）、乙酸乙酯萃取部分（13g）和正丁醇萃取部分（16g）。
1.2.2真海鞘壳化学成分的分离将石油醚萃取部分9g溶于适量的石油醚中，在石油醚溶液中加入15g的300～400目硅胶并搅拌均匀，挥发溶剂使样品充分吸附。用100g300～400目硅胶进行湿法装柱（2.5×70cm），先用石油醚平衡，将混有石油醚萃取部分硅胶加入到柱的上层，用石油醚：乙酸乙酯（100∶1-100∶100）的洗脱液进行梯度洗脱，每个比例进行5个柱体积的洗脱，分别收集洗脱液（每组分约600mL）。通过薄层层析法跟踪检测每个组分，并通过显色结果合并浓缩各组分，共得到8个组分，记为a、b、c、d、e、f、g和h组分（根据极性从小到大标记），a组分为化合物1（41mg），对b组分进行重结晶，得化合物2（120mg）。
）将正丁醇萃取部分16g溶于适量的乙酸乙酯中，并向其中加入24g的300～400目硅胶并搅拌均匀，挥发溶剂使样品充分吸附。用160g300～400目硅胶进行湿法装柱（3×100cm），先用乙酸乙酯平衡，将混有正丁醇萃取部分硅胶加入到柱的上层，用乙酸乙酯：甲醇（100∶1-100∶100）的洗脱液进行梯度洗脱，每个比例进行5个柱体积的洗脱，分别收集洗脱液（每组分约600mL）。通过薄层层析法跟踪检测每个组分，并通过显色结果合并浓缩各组分，共得到9个组分，记为a、b、c、d、e、f、g、h和j组分（根据极性从小到大标记），对c组分进行制备薄层色谱层析，对刮板洗脱浓缩得到的组分进行重结晶，得化合物3（10.5mg）。
1.2.3结构鉴定核磁共振光谱（NMR）在BrukerAvanceDRX500核磁共振仪（500/125MHz）上进行，以四甲基硅烷（TMS）作内标。
1.2.4真海鞘壳浸膏总甾体含量的测定按照田丽冉等的方法利用香草醛-硫酸溶液真海鞘壳浸膏进行总甾体含量的测定[4]。
1.2.5体外抗肿瘤活性测定称取真海鞘壳浸膏40mg，用20mL乙醇溶解配制成浓度为2mg/mL的药液备用。
）将HepG2细胞悬液接种于96孔培养板中（3×103个细胞/孔），于37℃5%CO2培养箱培养，加药之前在显微镜下对细胞进行观察。将药液加入96孔培养板中，终浓度分别为2μg/mL、20μg/mL及200μg/mL，共同孵育2h、6h、12h、36h，然后在显微镜下对细胞进行观察。同时，每孔加入10μLCCK-8，混匀后培养箱中孵育3h，测定450nm处的吸光值。
1.2.6数据处理实验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS13.0统计软件作单因素方差分析。
2结果与分析
2.1真海鞘壳浸膏的制备及化学成分的分离
）利用75%EtOH浸提所获得的真海鞘壳浸膏亲水性较大，其含水量为5.12%，其总甾体含量为14.13%。对真海鞘壳浸膏石油醚萃取部分进一步分离，得化合物1和化合物2。
）化合物1为白色似油状物。13CNMR（126MHz，CDCl3）δ107.31（s），114.11（s），139.26（s），39.44（s），37.44（s），37.17（s），34.73（s），33.89（dd，J=67.3，50.3Hz），33.27（s），32.82（s），32?00（s），30.11（m），29.78（d，J=5.1Hz），29.74（d，J=5.1Hz），29.44（s），29.03（m），27.16（s），26.77（s），24.54（s），23.24（s），22.73（m），19.77（m），14.20（d，J=7.8Hz），11.46（s），10?92（s），7.56（s），1.06（s）。以上波谱数据并结合维普数据库查询，确定化合物1为Diethyl24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate，分子式为C56H112O40（图1）[5]。
化合物2为白色针状固体，易溶于丙酮，可溶于甲醇及乙醇。醋酸酐-浓硫酸反应呈阳性，表明为甾体类化合物。13CNMR数据及维普数据库查询，与胆甾醇标准品一致，可以确定化合物2为胆甾醇（Cholesterol），分子式为C27H46O。
）对真海鞘壳浸膏正丁醇萃取部分进一步分离，得化合物3。化合物3为白色固体粉末，易溶于甲醇。1HNMR（600MHz，DMSO-d6）数据如下：δ8.13（s，1H），8.35（s，1H），7.35（s，1H），7.35（s，1H），5.87（d，1H，6.2Hz），4.61（dd，1H，6.0，11.4Hz），4.14（q，1H，3.3Hz），3.96（dd，1H，3.3，6.6Hz），3.65（dt，1H，12.0，4.0Hz），3.56（m，1H），5.45（d，1H，7.0Hz），5.18（d，1H，5.2Hz），5.44（m，1H）。13CNMR（150Mz，DMSO-d6）数据如下：δ156.3，156?3，149.2，152.5（C-3，C-4，C-6，C-7），119.5，140.6（V-1，C-5，C-6，C-8），149.2，88.09（C-2’，C-3’，C-4，C-7，C-8），73.8（C-1’），71.0（C-1’，C-4’），86.0，62.1（C-1’，C-3’）。以上波谱数据并结合维普数据库查询，确定化合物3为生物碱6-（2，，3，-dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol，分子式为C12H13NO6（图2）[6]。
2.2抑制人肝癌细胞HepG2生长活性测定
）不同浓度的真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养，不同培养时间后进行CCK-8检测，结果如图3。由图3可以看出，HepG2细胞在无药物添加的时候，随着培养时间延长，HepG2细胞以一定的速率增殖。当真海鞘壳总浸膏浓度为2μg/mL时，随着培养时间延长到36h时，培养液吸光度值下降，表明HepG2细胞增殖受到一定抑制。随着真海鞘壳总浸膏浓度增加，HepG2细胞增殖抑制效果逐渐增加。当真海鞘壳总浸膏浓度增大到为200μg/mL时，HepG2细胞增殖受到明显抑制。
真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后，对HepG2细胞进行形态学观察。对照组细胞边界清楚，折光度好，胞质饱满（图4A）。真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后的细胞有破损现象，细质内充满圆形、透明的颗粒，显示有较多脂滴（图4B）[7-8]。
3讨论
）对真海鞘壳75%（体积分数）的乙醇浸膏中石油醚萃取部分进一步分离，得到2个化合物，分别为Diethyl24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate（化合物1）和胆甾醇（化合物2）。对真海鞘壳浸膏正丁醇萃取部分进一步分离，得化合物6-（2，，3，-dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol（化合物3）。化合物1首次发现于从中国南海西沙群岛永胜岛附近海域里生长的海绵中[5]。化合物3首次发现于板栗中[6]。在真海鞘壳中发现化合物1与化合物3是首次报道。
）CCK-8法是一种优于MTT法的检测细胞增殖活性的方法，具有操作简单、灵敏度高、准确性和重复性好的特点[9]。在本研究中，使用CCK-8法对真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后的细胞进行计数。结果发现，真海鞘壳总浸膏对HepG2细胞具有显著抑制作用，且有剂量依赖性。真海鞘壳总浸膏中含有多种化学成分，其中比较多的化学成分有总甾体化合物，达到14.13%，这提示我们进一步研究，可以获得潜在的具有抑制HepG2细胞的化学成分。
）对真海鞘中活性物质的研究报道不多。Shirakata等从真海鞘体壁中分离出29kDa蛋白质]。Harada-Azumi等从真海鞘血淋巴中分离出一种分子量为28kDa的Ca2+依赖型的N-乙酰-半乳糖酰胺（N-acetyl-galactosamine）特异性的凝集素[11]。日本与韩国的研究者在真海鞘内发现了甘氨酸甜菜碱、龙虾肌碱、葫芦巴碱、氧化三甲胺、三甲胺等化学成分[2]。在真海鞘中不断发现的新化学成分，丰富了真海鞘活性物质的数据，为利用真海鞘提供了更多的可能性。
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参考文献：
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IsolationofconstituentsinHalocynthiaroretziDrascheselland
inhibitoryactivityofextractsfromH.roretziagainstHepG2cells
ZHAIXingyue1，HOUXiuxiu2，TONGChangqing2，DUYing3，LIWei2
（1.NutritionDepartment，TheSecondHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116023，China；
2.CollegeofFoodScienceandEngineering，DalianOceanUniversity，Dalian116023，China；
3.DalianCenterforDiseaseControlandPrevention，Dalian116021，China）
Abstract：ThreecompoundswereisolatedfromHalocynthiaroretziDrascheshellbycolumnchromatographyonsilicagelandthinlayerchromatography.Theirstructureswereidentifiedbyspectroscopicanalysisandphysical-chemistryproperties.TheinhibitiononHepG2cellsofallextractsfromH.roretzisellwereevaluatedbyCCK-8assay.TheresultsshowedthatthreecompoundswereobtainedandidentifiedasDiethyl24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate（compound1），cholesterol（compound2）and6-（2’，3’-dihydroxy-4’-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1’-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol（compound3）.AllextractsfromH.roretzisellusing75%EtOHexhibitedthepotentinhibitoryactivitiesagainstHepG2cells.Theextractscouldbeconsideredaspotentialanticancercandidateforfurtherstudy.
Keywords：HalocynthiaroretziDrasche；constituent；structuralidentification；HepG2cells
（收稿日期：2015-05-10）