张连水1，丁军2，张青松3，孟会贤4，叶国香1，宋建1，张进1
（1.沧州旺发生物技术研究所，河北沧州061001；2.沧州市水产技术推广站，河北沧州061000；
3.沧州市运河区农业局，河北沧州061001；4.河北工业大学，天津300130）
摘要：从沧州和天津地区共采集8个有效底泥样品，利用选择培养基从底泥中筛选出3株高效脱氮菌株，分别编号为31-A、33-A、41-A。3株菌株被分别鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillussphaericus）、蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）。实验中探究了不同的温度、pH、转速对三株菌株的生长量的影响，最适的温度为37℃，最适的pH为8.0，最适的转速为120r/min。将三株菌株进行不同的配比培养，分别处理人工废水，氨氮和亚硝酸盐氮的去除率高达87.22%、86.27%。
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关键词 ：微生态制剂；氨氮；亚硝酸盐；枯草芽孢杆菌；蜡状芽孢杆菌
随着水产养殖业的高速发展，大部分养殖户采用了工厂化高密度、掠夺式的作业模式，这无疑给水体生态系统带来了强大的压力。近年来，养殖池塘水体恶化问题日趋严重，主要表现有池塘老化、水域污染、黑臭底泥淤积、有害物质积累等，由此导致水产动物病害频发[1]。其中大量有毒的中间产物的富集——如氨氮、亚硝酸氮，是最主要的问题。亚硝酸盐氮能与生物体血红素结合成高铁血红素，造成组织缺氧；氨氮主要是对生物体产生强烈的神经性毒害，影响生理、生化各项指标与生长状况，严重时会造成大批生物死亡，其次高浓度的氨氮可以转化成亚硝酸盐氮[2-3]。因此，如何改善养殖水体水质是一个亟待解决的问题。
微生态制剂（Probiotics）是与“抗生素”相对一个概念[4]，又名活菌制剂（Bigone）或生菌剂，它一般是由人工培养菌群及其代谢产物和促进正常菌群生长的物质组成[5]。因为绿色环保、无残留、无毒副作用等特有的优势已广泛地应用在水产养殖业，成为抗生素最有潜力的替代品[6]，具有加速分解有机物质和降低生化需氧量以及氨氮、亚硝酸盐氮的含量的功能[7]。本文通过从自然界中筛选有效脱氮菌株来制备复合微生态制剂，在最适的生长条件下来处理人工废水，定时判断复合制剂的脱氮效果。
1主要仪器与方法
1.1主要仪器与材料
1.1.1主要仪器蚌式采样器、高压灭菌锅、超净工作台、光照培养箱、分光光度计、恒温振荡器、PCR仪、凝胶电泳仪
1.1.2材料混合培养基（营养肉汤培养基）：蛋白胨10g·L-1，牛肉膏5g·L-1，氯化钠5g·L-1，pH7.0。
硝化细菌培养基：葡萄糖5g·L-1，硫酸铵0?5g·L-1，氯化钠0.3g·L-1，磷酸氢二钾1g·L-1，硫酸镁0.3g·L-1，硫酸亚铁0.03g·L-1，氯化钙0.03g·L-1。
反硝化细菌培养基：硝酸钾2g·L-1，硫酸镁0.2g·L-1，磷酸氢二钾0.5g·L-1，酒石酸钾钠20g·L-1。
人工废水：硫酸铵0.47g·L-1，亚硝酸钠0.2g·L-1，葡萄糖1g·L-1，柠檬酸钠0.1g·L-1，磷酸氢二钾0.0175g·L-1。
1.2方法
1.2.1采样方法采集底泥时采用的蚌式采样器。为了避免采集的样品互相污染，在装置内衬一个塑料内套或者贴一层塑料膜，每采集一个样品更换一次。采集的样品分装到聚乙烯瓶子或盒子内，并及时做好标记。采集完样品后，要尽快将样品统一放入低温冰箱，并及时开展实验。底泥的存放最好不超过一个月。
1.2.2分离筛选方法分别称取50g筛选样品于100mL的烧杯中，加入无菌水100mL，充分震荡。静置5min，取上清液分别稀释10、102、103、104、105倍。将稀释后的菌悬液分别涂布在硝化细菌分离培养基、反硝化细菌分离培养基上，并在37℃下培养48h。每个样品的每个稀释度都要做对照实验和重复实验。
观察培养后的菌落形态，挑取不同的菌株在营养肉汤固体培养基上划线，37℃培养48h或更长。选取没有分开的菌落进行二次甚至三次划线分离。将最后分离的单菌落转移到斜面培养基上，4℃保存。再次将分离得到的菌株接种到硝化细菌分离培养基、反硝化细菌分离培养基上进行验证。
1.2.3鉴定方法
1.2.3.1形态学鉴定对筛选到的菌株进行革兰氏染色显微观察，菌体平板生长形态和结构观察。
1.2.3.2分子学鉴定按照基因组DNA提取试剂盒的步骤，提取其基因组；用通用引物扩增得到其16SrDNA，经纯化后电泳并送上海生工生物公司测序；测序结果与NCBI数据库比对，构建其系统进化树，确定其所属种属。
PCR反应扩增16SrDNA，50μL反应体系配制为：基因组DNA1μL，ExTaq0.25μL，10×ExTaqBuffer5μL，dNTPMixture4μL，上下游通用引物各1μL，最后补充双蒸水至50μL。反应条件为：反应前95℃预变性5min，后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，共30个循环，反应结束后再延伸10min。
1.2.4监测方法
1.2.4.1亚硝酸盐的测定—GB7493-87N-（1-萘基）-胺光法pH在1.7以下时，对氨基苯磺酸会和亚硝酸盐生成重氮盐，再与N-（1-萘基）-乙二胺偶联会生成红色染料。因此原来的水样就会变成红色，颜色越深说明亚硝酸含量越高，进而可以对比不同菌株的脱氮性能。于540nm波长处测量吸光度，根据试样吸光度和亚硝酸盐浓度成正比的关系，即可进行定量分析。
1.2.4.2氨氮的测定—GB11891-89纳氏试剂分光光度法游离态的氨或者铵离子与纳氏试剂反应会生成淡黄色的络合物，同样地，颜色越深说明含量越高，于波长420nm处测量吸光值可以进行定量分析。
2结果与分析
2.1鉴定结果
筛选得到3株高效脱氮菌株，分别编号为31-A、33-A、41-A，随即对其进行鉴定，鉴定结果为3株菌株分别是枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、赖氨酸球形芽孢杆菌（Lysinibacillussphaericus）、蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）。
2.2生长条件对生长量的影响
分别探究温度、pH和转速对三株菌株生长量的影响，实验结果分别见图1、2、3。
根据图1温度对生物量的影响结果可知，31-A、33-A、41-A三株菌株都没有抗热性，在温度为40℃时生长量就明显下降，最适合的生长温度都在37℃左右。因此，三株菌株混合培养的最适温度也为37℃。
根据图2pH对生物量的影响的结果可知，三株菌株在不同pH下生长的趋势大体是相同的，有一定的抗碱能力；pH在5~10之间时，生长状况差异不是很明显。根据图中结果可以确定三株菌株混合培养的最适pH设定为8.0。
根据图3转速对生物量的影响的结果可知，溶解氧是影响三株菌株生长量的一个关键因素。在60～120r/min时，随着转速的上升菌株的生长量也随着上升；但是随之转速继续上升，菌株生长量出现了下降的趋势。在高转速下出现生长量下降的原因可能是造成了菌株在培养基中分布不均匀，给测量带来了影响；也可能是高转速带来的高溶解氧量不适合菌株的生长。
综上所述，31-A、33-A、41-A三株菌株混合培养的最适温度为37℃，最适pH为8.0，最适转速为120r/min。
2.3水处理效果分析
将三株菌株进行配比，在最适条件下培养，培养后接种到人工废水中进行性能检测。
混合培养得到的复合微生态制剂的编号和相应的比例见表1。实验过程中先进行菌株之间1∶1的配比检测，结果发现三株混合菌的效果优于两株混合菌，再次进行1∶2的配比检测。
从表2和表3中的数据可以看出，三株混合菌株处理人工废水的效果都高于两株混合菌株的处理效果，三株菌株的混合制剂即4-10号处理的差异不是很大。表2去除氨氮的百分比随时间的变化表明第7个组合，即31-A、33-A、41-A菌的接种比例为2∶1∶1时，处理的效果最好；表3去除亚硝酸盐氮的百分比随时间的变化表明第9个组合，即31-A、33-A、41-A菌的接种比例为2∶1∶2时，处理的效果最好。总体而言，三株菌株按照1∶1比例或者是1∶2比例的效果都是可观的，进一步比较可得在应用实验中采用7号组合最好。
3结论
从沧州和天津地区共采集了8个有效底泥样品，随即对8个样品进行了分离筛选，得到了3株处理人工废水最佳的菌株，对它们进行编号为31-A、33-A、41-A。对筛选得到的3株菌进行了鉴定。鉴定结果说明31-A菌为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），33-A菌为球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillussphaericus），41-A菌为蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）。
对鉴定得到的3株菌株进行混合实验，实验结果表明31-A、33-A、41-A三株菌株混合培养的微生态制剂处理人工废水效果更好。培养过程中最适的温度为37℃，最适的pH为8.0，最适合的转速为120r/min。处理人工废水时，综合分析得出应用实验中采用31-A：33-A：41-A为2∶1∶1时，即7号组合处理废水的效果最佳。
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参考文献：
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