陈永平，张素青，李春青，高丽娜，时文博，李连庆
(农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心，天津 300221)
作者简介：陈永平（1979.3-），硕士研究生，工程师，毕业于中国海洋大学，现从事水产品质量安全工作。E-mail: jiamu008@ 163.com
DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2015.09.018
摘要：改进了淡水水体和沉积物中4种硝基呋喃代谢物呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃妥因代谢物（AHD）、呋喃西林代谢物（SEM）的高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测方法。方法采用内标法定量，提高了定量的准确性。水及沉积物样品直接进行衍生化后乙酸乙酯提取，化合物采用Thermo C18(5.0 μm，100 mm×2.1 mm)色谱柱进行分离，以0.1%甲酸/甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)为流动相梯度洗脱。方法的线性范围为0.1～200 ng/mL，r2≥0.999。空白水体在0.02、1.0、10?0 ng/L 3个加标水平下的平均回收率为75.4%～82.7%，相对标准偏差(RSD)为3.2%～8.7%，检出限(LOD)和定量下限(LOQ)分别为0.01 ng/mL和0.02 ng/mL。沉积物样品在0.3、1.0、10 μg/kg 3个加标水平下，平均回收率为77.9%～93.6%，RSD为2.5%～7.8%，检出限(LOD)和定量下限(LOQ)分别为0.1 μg/kg和0.3 μg /kg。该方法灵敏度高、选择性好，适用于实际淡水养殖环境水体和底泥中4 种硝基呋喃代谢物呋喃唑酮代谢物的残留测定。
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关键词 ：LC-MS/MS；淡水；沉积物；硝基呋喃代谢物
硝基呋喃是人工合成的广谱抗生素，因其对革兰氏细菌体内的氧化还原系统进行干扰被广泛用于预防和治疗此类细菌引起的肠胃道疾病[1-2]，原药经机体代谢产生的代谢物一部分与生物机体细胞膜蛋白结合成结合态，稳定存在于动物机体内，另一部分被排泄到体外，直接散布到养殖水体中，或沉积到池塘底部，随着时间的推移，被代谢物污染的水体或被排放到其他养殖区域，造成水体的二次污染，沉积到池塘底部的药物可能永久残存，只能靠单纯的自然降解来消除[3-7]。研究发现硝基呋喃类药物及其代谢物具有强的致癌致畸致突变等毒副作用，国内加大了对其代谢物的监控力度，但监控范围主要针对当前上市或产地水产品，还没有涉及到养殖环境监测。原因一方面养殖环境水体及沉积物中硝基呋喃类代谢物检测技术不够成熟，另一方面环境中的药物与生物体内的药物残留相关性了解不够清楚。监控不利导致环境中的药物再次被生物体吸收、富集残存在体内，因此从扩大监控范围，从根源消除代谢物残留十分必要。目前文献主要报道了水产品中硝基呋喃类代谢物检测技术[8]，淡水及沉积物中的硝基呋喃类代谢物的测定未见报道。
本文研究采用对于淡水养殖水体及沉积物直接衍生提取，过微滤膜，采用高效液相色谱串联质谱对其进行测定，具有高效、灵敏、稳定的特性，可作为养殖环境的监控手段。
1实验部分
1.1仪器与试剂
AB 4000 Qtrap三重四极杆质谱(AB Sciex)，电子天平(MettLer ToLedo 公司)；高速冷冻离心机(Sigma公司)；高速组织匀浆机（飞利浦公司 转速10 000 r/min），MS1 Mini-shaker 涡轮振荡器(IKA 公司)；MiLLi-Q纯水器(MiLLipore 公司)；氮吹仪（Organomation Associates 公司）；移液器(10、20、100、200、1000 μL，Eppendorf 公司)。
AHD、SEM、AMOZ、AOZ 标准品(德国Dr.Ehrenstorfer 公司)；AHD-13C3、SEM-15N13C、AMOZ-D5、AOZ-D4(德国Dr.Ehrenstorfer 公司)；二甲基苯甲醛(色谱纯，天津四友科技有限公司)；甲醇（质谱纯，Thermo 公司）；正己烷(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；乙酸铵(色谱纯，天津四友科技有限公司)；甲酸(色谱纯，科密欧公司)；浓盐酸(优级纯，天津四友有限公司)；磷酸氢二钾( 分析纯，天津光复科技发展有限公司)。
1.2溶液配制
1.2.10.002 moL/L醋酸铵溶液称取0.15 g醋酸铵，用水溶解并定容至1 000 mL。
1.2.2甲醇溶液甲醇∶水=5∶95（V/V）。
1.2.30.2 moL/L盐酸溶液量取浓盐酸（ρ=1.19 g/mL）18.0 mL，用水稀释至1 000 mL。
1.2.40.05 moL/L 2-硝基苯甲醛溶液称取0.037 8 g 2-硝基苯甲醛，溶于5 mL二甲亚砜中，现用现配。
1.2.5磷酸氢二钾溶液1.0 moL/L。称取87.1 g磷酸氢二钾，溶解于500 mL水中。
1.2.6同位素内标储备液AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM·HCl-13C -15N2，浓度均为100 μg/mL。分别准确称取10.0 mg AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM·HCl-13C-15N2内标标准物质，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配成浓度为1.0 mg/mL内标标准储备液，-20℃冷冻保存。
1.2.7AOZ标准储备溶液1.0 mg/mL。准确称取10.0 mg AOZ，用甲醇溶解避光定容至10 mL棕色容量瓶中，-20℃冷冻保存。
1.2.8AMOZ标准储备溶液1.0 mg/mL。准确称取10.0 mg AMOZ，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，-20 ℃冷冻保存。
1.2.9SEM标准储备溶液1.0 mg/mL。准确称取14.9 mg SEM·HCl，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，-20 ℃冷冻保存。
1.2.10AHD标准储备溶液1.0 mg/mL。准确称取13.2 mg AHD·HCl，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，-20 ℃冷冻保存。
1.3样品前处理
1.3.1养殖淡水水样取水样10 mL于50 mL塑料离心管中，加入硝基呋喃代谢物内标50μL（100 ng/mL），加入6.0 mL盐酸溶液，再加入200 μL衍生试剂，漩涡2 min，置于恒温水浴振荡器上35 ℃避光振荡约16 h，取出离心管冷却至室温后，加入5.0 mL磷酸氢二钾溶液，加入10 mL乙酸乙酯，漩涡2 min，以10 000 r/min离心3 min，于40 ℃氮气吹至近干，残渣用1.0 mL流动相溶解，过0.2 μm滤膜，待上机。
1.3.2沉积物样品取风干后的沉积物样品5?0 g于50 mL塑料离心管中，加入硝基呋喃代谢物内标50 μL（100 ng/mL），再加入200 μL的衍生试剂，加入5.0 mL盐酸溶液，漩涡2 min，然后置于恒温水浴振荡器上35 ℃避光振荡约16 h，取出离心管冷却至室温后，加入5.0 mL磷酸氢二钾溶液，加入10.0 mL乙酸乙酯，漩涡2 min，以10 000 r/min离心5 min，于40 ℃氮气吹至近干，残渣用1.0 mL流动相溶解，过0.2 μm滤膜，待上机。
1.4仪器分析条件
1.4.1色谱条件
色谱柱：Thermo C18(5.0 μm，100 mm×2.1 mm)，或性能相当者；
柱温：30 ℃；
进样量：10.0 μL；
流动相：A：0.002 moL/L醋酸铵溶液，C：甲醇；梯度洗脱程序见表1。
1.4.2质谱条件
离子化模式：大气压电喷雾离子源（ESI），正离子模式；
Ionspray voltage：5500 v；
Temperature：550℃；
Curtain Gas :25；
Collision Gas(CAD):Medium；
Gas1:70；
Gas2:40。
扫描模式：选择反应监测（SRM），选择反应监测母离子、子离子及碰撞能量见表2。
2结果与讨论
2.1色谱质谱条件的选择
流动相无机相选择水相中加入一定量乙酸铵（5 mmoL·L-1），再加入一定量甲酸（0.1%），增强各化合物离子化效果，目的是为了增加各组分的保留时间，改善各组分的峰形。流动相有机相选择甲醇和乙腈作对比实验，结果表明甲醇和水相配合做流动相时，化合物分离效果较好。
取衍生好的四种硝基呋喃代谢物100 ng·mL-1标准溶液，用蠕动泵将四种代谢物的衍生溶液注入离子源，在ESI(+)离子化模式下，分别对喷雾电压、离子源温度、GAS1、GAS2、碰撞能量等条件进行优化，优化参数见表1。
2.2色谱柱的选择
分别选择Thermo C18柱（5μm, 100×2.1 mm i.d.），岛津 C8柱（2.1 μm, 100×2.1 mm i.d.），Agilent C18柱（5μm, 100×4.6 mm i.d.）以乙酸铵溶液、甲醇为流动相梯度洗脱，Thermo C18柱出峰分离效果均好于岛津 C8柱、Agilent C18柱，最终实验选择Thermo C18柱（5μm, 100×2.1 mm i.d.）作为四种代谢物分离色谱柱。
2.3衍生化时间的选择
实验设计在沉积物中添加同一浓度（1.0 μg/Kg）的四种硝基呋喃代谢物，加入2-硝基苯甲醛(0.05 moL/L)150、200μL，参考相关文献温度设定为35、37 ℃，衍生化时间设定为2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、18 h、20 h，结果表明衍生化试剂为200 μL、35 ℃条件下衍生16 h时衍生化最充分、衍生物最稳定。
2.4方法的标准曲线与灵敏度
通过优化，用内标法定量四种呋喃类代谢物的线性范围，结果显示两者质量浓度均在0.2～200 ng/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系，r2 大于0.999。回收率均大于80%，按S/N＞3计算得该方法在环境水样和底泥样品中的检出限( LOD) 分别为0.01 ng /mL 和0.1μg /kg，以信噪比S/N＞10得其定量下限(LOQ)分别为0.02 ng /mL和0.3 μg /kg。
2.5方法的回收率与精密度
在空白环境水样中四类呋喃类代谢分别添加0.02、1.0、10.0 ng/L 3个浓度梯度，沉积物中四类呋喃类代谢分别添加0.3、1.0、10.0 μg/kg 3个浓度梯度，同时每个浓度的实验重做五次，按照本方法处理后测定，回收率和相对标准偏差见表3。沉积物中AOZ的平均回收率为77.9%～88?4%，RSD 为2.5%～7.2%，AMOZ的平均回收率为86.6%～90.8%，RSD 为1.9%～7.8%，SEM的平均回收率为90.4%～92.5%，RSD 为3.5%～6.2%，AHD的平均回收率为87.3%～93.6%，RSD 为1.4%～4.6%；水体AOZ的平均回收率为77.9%～88.4%，RSD 为3.2%～6?1%，AMOZ的平均回收率为76.2%～78.6%，RSD 为3.3%～7.3%，SEM的平均回收率为78?8%～81.3%，RSD 为2.9%～8.4%，AHD的平均回收率为76.8%～82.7%，RSD 为5.7%～8.7%。因此，本方法具有较高的准确性、灵敏性、稳定性。
3结论
本文通过优化淡水及沉积物中四种硝基呋喃类代谢物提取净化、色谱质谱条件，改进了水产养殖环境淡水水体和沉积物中呋喃类代谢物残留测定方法。结果表明，本方法在0.2～200 ng/mL 范围内呈现良好的线性关系，水体和沉积物中的定量限分别为0.02 ng/mL和0.3 μg/kg。可作为淡水水体和沉积物中呋喃类代谢物残留的检测方法，成果应用可为养殖环境中代谢物监控，生物体与养殖环境之间相关性分析及环境安全评价提供分析手段，也为水产品中药物溯源提供技术支持。
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(收稿日期：2015-07-01；修回日期：2015-07-06)