doi：10.13360/j.issn.1000-8101.2015.04.030中图分类号：S763
曾学英
（四川师范大学，成都 610068）
摘要：2014年笔者首次在四川攀枝花大叶桉种植区内发现疑似大叶桉炭疽病病害，通过对发病植株病健交界处叶片采样、分离、单孢培养及致病性测定，得到1株具有代表性的菌株Z-D-07，结合形态学以及基于rDNA?ITS序列的系统发育对该菌株的种类进行鉴定。结果表明，该菌株形态学特性与博宁刺盘孢Colletotrichum boninense一致；利用真菌通用引物ITS1和ITS4进行rDNA的扩增，对扩增产物进行回收、克隆、测序，得到597 bp的基因片段，通过登陆NCBI进行Blast比对，注册登录号为KJ619456，并建立同源性较高的Colletotrichum属菌株的系统发育树，确定菌株Z-D-07为炭疽菌属胶胞炭疽菌Colletotrichum boninense。分别选用6种常见农药对大叶桉炭疽病菌进行室内药剂防治试验，发现70%代森锰森锰锌防治效果最好，80%炭疽福美次之。
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关键词 ：大叶桉；炭疽病；盘长孢状刺盘孢；系统发育树；药剂防治
Identification of the pathogen causing Eucalyptus anthrax and laboratory screening of fungicides
∥
ZENG Xueying
Abstract：We first discovered a suspected disease named anthrax Eucalyptus robusta planting regions in Panzhihua， Sichuan， in 2014. We obtained the representative strain Z-D-07 with the methods of sampling， separation， single spore culture， as well as pathogenicity tests， and we also identified the species of Z-D-07 based on morphological and developmental systems rDNA?ITS sequences. The results showed that the strain Z-D-07 in morphological characteristics were consis?tent with Colletotrichum boninense. By using the fungal universal primers ITS1 and ITS4， we amplified the internal transcribed spacer rDNA sequences of the strain Z-D-07， then after recyclying， cloning and sequencing the amplification products， a length of 597 bp gene fragments was obtained. The results of blast in Genebank， the analysis of fungal rDNA systemic development and phylogenetic tree showed that the relation between this fragment and the fungi of Colletotrichum boninense was closest， so morphological and molecular identification confirmed this fungal pathogen strain Z-D-07 as Colletotrichum boninense. Six kinds of common pesticides were used to study the control effects on Eucalyptus anthrax in the test， the results showed that 70% mancozeb presentd the optimum control efficiencies， and 80%thiram took second place.
Key words：Eucalyptus robusta Smith；anthrax；Colletotrichum boninense；phylogenetic tree； termiticides
Author’s address： Sichuan Normal University，Chengdu 610068，China
收稿日期：2015-01-07
修回日期：2015-03-29
基金项目：四川省科技支撑项目（2011YZGG-10）。
作者简介：曾学英（1965-），女，硕士，研究方向为植物资源开发与利用。 E?mail：269670236@qq.com
桉树是世界三大速生造林树种之一，具有生长周期短、易存活、适生范围广、轮伐期短、用途多样化等优点，在我国西南地区被大规模的引种和栽培，尤其以四川攀枝花、广元、乐山为主要栽培区。大叶桉（Eucalyptus robusta Smith）是桉树属极具代表性的树种之一，同时是重要的经济用材树种，树干被广泛的用于林业生产建设，枝叶内含有的某些被誉为“大叶桉脑”的特殊化学物质是重要的药材原料，同时是长江中下游地区生产生态建设的重要树种［1］。因此，大叶桉在西南地区的生态环境建设以及解决生物能源问题中发挥着不可替代的作用，具有重要的经济、社会、生态效益［2］。目前世界范围内有关桉树病害的报道较多，主要以桉树焦枯病（Cylindrocladium scoparium和C. quinqueseptatum）［3］、紫斑病（Phaeoseptoria eucalypti）［4］、青枯病（Pseudomonas solanacearum）［5］、灰霉病（Botrytis cinerea）［6］、叶斑病（Pseudocercospora eucalypti）［7］为主，对桉树炭疽病病原菌的报道仅限于胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）［8］，而对于本研究发现的大叶桉炭疽病原菌——博宁刺盘孢（Colletotrichum boninense）及生物学特性的研究属首次报道。
2013年，四川攀枝花、乐山、新津、广元等多个大叶桉种植区首次发现疑似大叶桉炭疽病病害，其为害症状与国家林业局检疫对象大叶桉焦枯病相似度极高，轻者造成大叶桉叶片出现浅褐色至红褐色病斑，重则造成叶片蜷缩变形，植株枯萎死亡［3］。为明确四川地区疑似大叶桉炭疽病的病原菌种类，笔者对发病植株病原菌进行分离和致病性测定，结合形态学及rDNA-ITS序列分析确定了病原菌种类，并对大叶桉炭疽病菌的室内进行筛选试验，以期为大叶桉炭疽病的有效防治奠定理论基础。
1材料与方法
1.1大叶桉炭疽病害的野外调查
2014年6月，对攀枝花市仁和区大叶桉种植1号园区内的大叶桉病害进行记录、调查，采用“Z”字抽样的方法，对园区内炭疽病害的感病程度进行分级处理，根据实际感病情况共分5级，叶片的病情指数分级标准：0级为无病，1级、2级、3级、4级的单叶病斑数分别为1～5、6～10、11～15、16个以上，然后按照公式计算园区内大叶桉炭疽病病害发生情况的感病指数。随机选取园区内疑似大叶桉炭疽病发病植株10株，每株采集不同发病程度2年生叶片10片，放入冰壶内带回实验室，4 ℃冰箱内保存，等待病原菌的分离，培养试验。
病情指数=∑（病级株数×相对应代表数值）/株数总和×发病最重的代表数值×100%。
1.2病原菌的分离、培养及致病性测定
病原菌的分离采用常规组织分离法，具体参照韩永超等［9］的方法。将分离得到的具有代表性的菌株Z-D-07接种到已配制好的马铃薯琼脂（PDA）培养基［10］上，培养48 h后用无菌水洗下，结合冷怀琼等［11］对炭疽菌产孢条件的研究，25 ℃，pH 7，黑暗与光照交替处理条件下连续培养5～7 d，收集分生孢子，用无菌水稀释成3×104 cfu/mL浓度，制成病原菌孢子悬浮液。取孢悬液100 mL，均匀的涂抹于室内水培1年生大叶桉枝条的健康叶片叶背处（75%酒精表面消毒，无菌水冲洗3～5次），同时以涂抹无菌水的叶片作为空白对照，每试验3组重复。15 d后观察叶片感病情况，与自然发病叶片比较，同时对感病叶片再次进行病原菌的分离，与菌株Z-D-07形态学比较分析。
1.3形态学观察
菌株Z-D-07的肉眼及显微形态学观察参照李婕等［12］的方法。
1.4基于rDNA-ITS序列的分子生物学鉴定
1.4.1DNA的提取
供试菌株Z-D-07菌丝的提取采用液体摇床震荡培养的方法，具体参照Wang等［13］的方法，略有改动。接种菌株Z-D-07于PDA培养基上，室温下连续培养5 d后，取菌落边缘菌丝少许，转接于瓶装量为40 mL的PDB液体培养锥形瓶（100 mL）中，25 ℃，pH 7，125 r/min条件下震荡培养5～7 d。将无菌水冲洗、纱布过滤后收集到的菌丝置于-20 ℃条件下保存、备用。基因组DNA的提取主要参照天根植物基因组DNA提取试剂盒的操作步骤，具体可参照韩振云等［14］的方法。
1.4.2PCR扩增
rDNA片段的扩增引物选择为上海生工公司合成的真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。反应扩增体系（20 μL）包括：基因组DNA（1 μL），10× PCR buffer（2 μL），dNTP（0.25 mmol/L，1 μL ）， rTaq（5 U/μL，0.2 μL），Primer1（1 μmol/L，0.5 μL），Primer2（1 μmol/L，0.5 μL），ddH2O（14.8 μL）。反应程序为：96 ℃预变性 5 min；进入循环，94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR产物的检测在1.5%琼脂糖凝胶电泳上进行。
1.4.3产物的回收、克隆、测序
参照林剑伟等［15］的试验，利用回收试剂盒对目标基因片段进行切胶、回收、纯化。将回收得到的DNA通过与T载体（pMD18-T）连接后转入到感受态大肠杆菌内，最后选取阳性克隆产物送至生物公司进行测序。
1.4.4ITS序列分析及系统发育树的构建
根据生物公司发回的片段序列，登陆NCBI进行Blast比对，从GeneBank中下载同源性较高菌株的rDNA-ITS序列，利用MEGA 5.0建立菌株Z-D-07的系统发育树，进行基于rDNA-ITS的序列分析。
1.5室内药剂筛选
大叶桉炭疽病病原菌抑菌药剂筛选试验参照黄祖旬等［16］的方法，略有改动。选取甲基硫菌灵，70%代森锰锌，80%炭疽福美，75%百菌清，50%多菌灵，50%异菌脲，分别稀释成500，800，1 000，1 500倍液，各取2 mL添加到含有PDA培养基的平板中（直径为90 mm），然后接种Z-D-07菌饼，25 ℃，pH 7条件下培养7 d后测定菌落直径，同时接种不添加药剂平板作空白对照。
2结果与分析
2.1大叶桉炭疽病的发生情况
采用“Z”字抽样的方法对攀枝花大叶桉1号种植区内病害调查结果显示，受到病原菌侵染的大叶桉叶片与大叶桉焦枯病发病症状类似，从叶部边缘开始出现颜色改变的症状，侵染初期，叶片边缘出现淡黄色至浅褐色不等程度的圆斑，并伴有红色环状圈，随着病情加重，叶片出现形变，甚至枯萎的症状，湿润环境下，叶片背面会出现红色或红褐色的孢子堆。根据提前制定的大叶桉炭疽病分级标准，5个等级均有不同程度的发生（表1），其中以1，2，3等级发生较为普遍，4，5等级较少，虽然健康植株所占比例较高，达到36.58%，但各等级感病指数总计达到30.70，由此可知该地区大叶桉炭疽病的发生较为严重。
2.2病原菌的分离、培养及致病性
通过常规组织分离法对100个发病样品进行病原菌的分离，25 ℃，pH7条件下于PDA培养基上培养5～7 d后，得到58株白色至灰白色圆形优势菌落，其形态学一致，故将其标记为优势菌株Z-D-07。将优势菌株Z-D-07制备的孢子悬浮液回接到室内水培1年生大叶桉枝条叶片15 d后，与图3对照健康叶片相比，几乎全部人工接种的叶片均出现不同程度的感病情况，且其感病症状与从攀枝花大叶桉种植园区的发病植株的叶片症状完全一致，均出现不同程度的红色圆斑，并伴有红色环状圈（图1），说明该优势菌株是引起园区内大叶桉叶部病害的病原菌。但室内接种（人工诱发）的感病症状与自然发病相比，其发病面积较小，感病指数略低，这可能是由于室内环境相对于自然环境更稳定，受到干扰因素更少，因此其发病症状没有自然条件下明显，而自然条件下的多方面因素（风、雨、温度、湿度、其他病原菌等）干扰也可能成为大叶桉炭疽病大面积发生的潜在致病条件。
2.3病原菌的形态学特征
将拟确定的优势菌株Z-D-07接种到含PDA的平板上，25 ℃，pH7条件下培养5～7 d后，观察到有橘黄色圆形菌落长出，菌落边缘整齐，菌丝稀疏，白色，后期形成大量子囊壳。待菌落产生分生孢子后，取样制成玻片，显微镜下观察到分生孢子盘生于寄主表皮下，暗褐色，无刚毛；产孢细胞单胞，无色，圆柱形或哑铃形，大小为（8.0～18.0）μm×（4.0～6.5）μm；分生孢子单胞无色，圆柱形，多数一端钝圆，一端稍尖，具脐点。优势菌株Z-D-07的形态学特性与Mills等［17］、Osorio等［18］、Guo等［19］的研究结论一致，因此初步判定该病原菌为大叶桉炭疽病的病原菌Colletotrichum boninense。
2.4基于rDNA-ITS序列的分子生物学鉴定结果
在初步依据形态学鉴定的基础上，利用真菌通用引物ITS1和ITS4对菌株Z-D-07进行基于rDNA-ITS序列的分子生物学鉴定。在1.5%琼脂糖凝胶电泳检测下，能够得到一条清晰的500 bp大小的DNA片段（图2），且该片段无拖尾现象，表明DNA纯度较高，没有出现污染现象，可满足后续测序要求。
利用回收试剂盒对目标基因片段进行切胶、回收、纯化后将回收得到的DNA通过与T载体（pMD18-T）的连接，转入到感受态大肠杆菌内，得到白色菌落，挑取白色菌斑克隆，PCR扩增，检测到多个蓝色斑点，即克隆成功且均包含目的基因片段（图3）。选取阳性克隆成功的菌株经生工公司测序得到一条597 bp的序列。根据生物公司发回的片段序列，将该序列上传至NCBI，注册登录号为KJ619456，进行基于ITS序列的同源性分析。
对该菌株进行同源性ITS序列的Blast比对，发现菌株Z-D-07与14株Colletotrichum属菌株同源性达到100%，其登录号分别是JN413079，JN413080，JX010173，KC790939，JX010231，JF710577，JX902417，GU935881，JQ926743，AF059676，AB738859，JQ005760，KF550281，KF550282，KC790943，因此判断Z-D-07菌株为Colletotrichum属。从GeneBank中下载同源性较高菌株的rDNA-ITS序列，利用MEGA 5.0建立菌株Z-D-07的系统发育树，进行基于rDNA-ITS的序列分析（图4）。
2.5室内药剂筛选结果
根据病原菌鉴定结果，确定Z-D-07菌株为盘长孢状刺盘孢Colletotrichum boninense，是引起大叶桉炭疽病的致病菌。在此基础上，选取6种农药分别稀释至500，800，1 000，1 500倍液进行对大叶桉炭疽病菌的室内药剂筛选试验（表2），结果表明，70%代森锰锌1 000倍或1 500倍液对大叶桉炭疽菌的生长起到明显的抑制作用，80%炭疽福美也具有明显抑菌作用，50%异菌脲抑菌作用效果最不明显；结合表2不同药剂种类对病原菌的抑菌效率，可以看出6种农药对大叶桉炭疽病菌的抑制效果从高到低分别是：70%代森锰锌、80%炭疽福美、75%百菌清、甲基硫菌灵、50%多菌灵、50%异菌脲。因此，判断70%代森锰锌1 000倍或1 500倍液对大叶桉炭疽病原菌的抑菌效果最好，可以作为生产大叶桉炭疽病化学防治的首选农药。
3结论与讨论
植株病害的发生与病原菌的种类及生物学特性密切相关。不同病原菌侵染植株后引发的病症有时极其相似，无法用肉眼鉴定病害种类，这就需要借助于分子生物学手段进行病症与病原菌的区分。目前，常用的真菌病原菌的鉴定方法主要有形态学和分子生物学两大类，以形态学鉴定为主［20］。传统的真菌形态学鉴定一般依据菌落形态、菌丝形态、分生孢子大小以及菌株的生理生化指标等进行分类鉴定，但是其需要鉴定者具备扎实的专业基础，花费时间较长，且容易产生错误判断。相对于传统的形态学方法，利用分子生物学技术鉴定菌株上存在明显优势，具有快速、准确、易操作的特点［21］。真菌的ITS序列即指真菌的核糖体基因内转录间隔区（internal transcribed spacer， ITS），是位于核糖体RNA18S，5.8S和28S之间的小基因片段，是具有高度保守性的编码区域。菌株种类不同，其ITS序列不同，因此可根据该区域序列的稳定性、保守性和差异性对不同菌株的ITS序列进行扩增，从而进行基于ITS序列的常规分子生物学鉴定［22］。就本研究所涉及到的可引起炭疽病的病原菌（Colletotrichum gloeosporioides）和（Colletotrichum boninense）而言，二者在形态学上极具相似性，仅利用形态学鉴定无法进行区分，因此辅佐以分子生物学手段进行准确鉴定十分必要。
根据文献报道，目前由胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的植株病害十分普遍，且其寄主植株广泛，可不同程度的引起多种植株炭疽病害［23-28］，例如梨炭疽病、黄柏炭疽病、芒果炭疽病、草莓炭疽病、锦葵炭疽病、核桃炭疽病等，受到Colletotrichum gloeosporioides侵染的植株严重降低了经济价值。但是，对于大叶桉炭疽病的报道甚少，笔者于2014年首次在四川攀枝花大叶桉种植区内发现疑似大叶桉炭疽病病害，受到病原菌侵染的大叶桉叶片与桉树焦枯病发病症状类似，从叶部边缘开始出现颜色改变的症状，侵染初期，叶片边缘出现淡黄色至浅褐色不等程度的圆斑，并伴有红色环状圈，随着病情加重，叶片出现形变，甚至枯萎的症状，湿润环境下，叶片背面会出现红色或红褐色的孢子堆，为弄清该病原菌种类，通过采样、分离、单孢培养及致病性测定，得到一株代表性菌株Z-D-07，并结合形态学以及基于rDNA-ITS序列的系统发育将该菌株鉴定为博宁刺盘孢（Colletotrichum boninense），确定其为引起大叶桉炭疽病的病原菌。与胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起林木病害炭疽病的普遍性不同，博宁刺盘孢（Colletotrichum boninense）所能够引起的林木炭疽病寄主范围十分有限，这也是国内首次在林木植株上发现其为病原菌的实例。
为有效防控大叶桉炭疽病的发生，随机选用6种农药对Colletotrichum boninense进行了室内药剂防治试验。研究结果显示，70%代森锰森锰锌1 000倍液和1 500倍液防治效果最好，80%炭疽福美次之，这也为大叶桉炭疽病的化学防治提供了的理论依据。但是，鉴于化学防治存在污染、长期使用易诱导产生抗药性、对人畜为害等缺点，因此对于大叶桉炭疽病的生物防治技术有待于更深入研究。
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（责任编辑 刘博）