doi：10.13360/j.issn.1000-8101.2015.04.008中图分类号：S718.43
葛敏凯1，王德炉1*，周云超1，何滔2
（1.贵州大学林学院，贵阳 550025；2.贵州省湄潭县林业局）
摘要：通过砂培试验，研究了5个供氮水平对粗壮女贞叶片生理特性以及叶片内含物含量的影响。结果表明：氮浓度为5.8 mmol/L时，粗壮女贞氮素不足，植株叶绿素总量最低，植株生长受到抑制，但叶片内含物含量较多；而氮浓度为15.0 mmol/L时，与其他处理相比，粗壮女贞氮素充足，整体生理机能良好，生长速率较高，叶片中游离氨基酸含量较高，但水浸出物和皂甙含量最低，叶片中其他内含物含量也受到了一定影响。
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关键词 ：粗壮女贞；氮；生理特性；叶片内含物；苦丁茶
Effects of nitrogen on some physiological characteristics and inclusion contents in leaves of Ligustrum robustum
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GE Minkai， WANG Delu， ZHOU Yunchao， HE Tao
Abstract：We studied separately the effects of five levels of nitrogen treatments on physiological property and inclusion contents in the leaves of Ligustrum robustum in a sandy culture experiment.These results showed that under the 5.8 mmol/L nitrogen treatment， the chlorophyll content was the lowest， and the plant growth was restrained because the nitrogen was not enough for the L. robustum， but the inclusion contents in leaves were much higher. Under the 15.0 mmol/L concentration of nitrogen treatment， the physiological function was well， which led the plant to a much higher growth rate with more free amino acid content in the leaves， because the nitrogen was sufficient for the plant. But the aqueous extracts and saponin contents in leaves were the least， the other inclusions except for aqueous extracts and saponin were also influenced.
Key words：Ligustrum robustum； nitrogen； physiological characteristics； inclusion contents in leaves； kuding tea
First author’s address： College of Forestry， Guizhou University，Guiyang 550025，China
收稿日期：2015-01-29
修回日期：2015-05-09
基金项目：贵州省农业科技攻关项目（黔科合NY字［2007］3040号）。
作者简介：葛敏凯（1989-），男，硕士生，研究方向为林木栽培生理生态与分子生物学。通信作者：王德炉，男，教授。E?mail： fc.dlwang@ gzu.edu.cn
在农业生产中，氮肥是增产效果最为显著的一类化学肥料，它对提高作物产量，改善农产品质量有十分重要的作用［1］。但不合理的使用速效氮肥会造成其利用率明显降低，未被利用的氮素中小部分仍保留在土壤中，大部分通过硝化和反硝化作用，以NO3-和N2O形式排放到环境中造成污染［2］。粗壮女贞（Ligustrum robustum）属木犀科植物，其叶片制成的代茶饮料俗称苦丁茶［3］，含有许多生物活性成分和抗氧化物质［4-5］，具有良好的保健功效，在我国南方有悠久的饮用历史。近年来，有研究表明氮肥对茶叶的干物质产量和品质有明显的影响，合理的施氮量能显著提高茶叶产量并改善其品质［6］，但有关女贞属苦丁茶植物的研究少见报道。为此，本试验在不同施氮水平对砂培粗壮女贞生理和叶片内含物含量的影响进行研究，以期掌握粗壮女贞对氮素的需求范围，为生产上合理施用氮肥减少环境污染提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
选择生长状况一致的3年生粗壮女贞实生苗，采用石英砂砂培方式进行试验。石英砂经5%稀HCl浸泡6 d后，先用自来水清洗，再用蒸馏水洗至以硝酸银试剂测试无Cl-为止。然后用试验营养液反复浸洗，直至浸出液pH 24 h变化不大，以免砂粒表面吸附的氢离子危害植株。最后装入深18 cm、口径21.5 cm、底径18 cm的聚丙烯塑料花盆内。营养液采用国际通用的霍格兰（Hoagland）大量元素营养液和阿农（Amon）微量元素营养液的混合液（本试验为全剂量，每升大量元素营养液加入1 mL微量元素营养液的1 000倍母液）。
1.2试验设计
试验在温室大棚内进行。在营养液pH 5.5的条件下［7］，设置5个不同浓度的氮肥营养液处理，即N浓度 1.2，5.8，10.4，15.0和19.6 mmol/L，每个处理重复3次，每个重复6株。试验苗木按照试验设计定植于装有6 kg石英砂的花盆中，每盆1株，用自来水空白培养15 d后每5 d浇1次营养液，每盆每次100 mL营养液，培养30 d后采集相同部位叶片进行各项指标的测定。
1.3测定方法
1.3.1取样方法
取4叶2芽鲜叶，用蒸馏水洗干净并用吸水纸吸干后置于110 ℃恒温箱20 min，再降温至80 ℃干燥12 h，研磨后过80目筛，供品质指标测定之用；生理特性指标的测定用新鲜叶片。
1.3.2指标测定
光合色素用丙酮提取法；丙二醛（MDA）用硫代巴比妥酸（TBA）法；脯氨酸（Pro）用茚三酮显色法；超氧化物歧化酶（SOD）用靛蓝四唑（NBT）法；过氧化氢酶（CAT）的测定用高锰酸钾滴定法；水浸出物含量测定用差数法；皂甙含量的测定用对二甲氨基苯甲醛法；可溶性糖的测定用蒽酮比色法；氨基酸的测定用茚三酮比色法；茶多酚的测定用酒石酸铁比色法；儿茶素的测定用香荚兰素比色法［4-6］。
2结果与分析
2.1氮对粗壮女贞生理特性的影响
2.1.1对叶片光合色素的影响
在不同氮浓度处理下，粗壮女贞叶片光合色素含量变化显著（表1）。随着氮浓度的增大，粗壮女贞叶片叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）、类胡萝卜素（Car）和叶绿素总量［Chl（a+b）］均呈先增大后减小的趋势。叶绿素含量在氮浓度为15.0和10.4 mmol/L时差异不显著，其中Chl（a+b）和Chl a显著高于其他3个处理，氮浓度为15.0 mmol/L时Chl a、Chl b和Car分别比氮浓度为1.2 mmol/L时增加了34.00％，36.36％和38.10％，而Car含量较少，差异未达到显著水平。叶绿素a/b（Chl a/b）随着氮浓度的增加变化并不明显，仅在最大值（氮浓度为19.6 mmol/L时）与最小值（氮浓度为5.8 mmol/L时）之间差异显著，也只相差了0.23个单位，其余处理间差异均不显著。可见，氮对粗壮女贞叶片中叶绿素a和叶绿素b的含量产生了同等影响效果。
2.1.2对叶片丙二醛含量的影响
丙二醛（MDA）是膜质受到活性氧伤害而发生过氧化的产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度［8］。适宜的氮素营养水平可以使胁迫条件下植株叶肉细胞膜的相对透性维持在较低的范围内，并且能促进植物叶片光合速率。缺氮或氮素营养水平过高，都会增加植物叶肉细胞MDA含量［9］。粗壮女贞叶片中MDA的含量随着氮浓度增加呈先下降后上升的趋势，氮浓度为5.8 mmol/L时最小，显著低于其他4个处理，氮浓度为19.6 mmol/L时最大，与其他4个处理间差异显著（表2）。说明粗壮女贞在氮浓度为5.8 mmol/L时膜质过氧化作用小，遭受胁迫伤害程度低。
2.1.3对叶片脯氨酸含量的影响
脯氨酸（Pro）是植物渗透调节物质之一。植物的Pro合成、累积及代谢是一个受非生物胁迫和细胞内Pro浓度调控的生理生化过程。Pro积累可能是植物受到胁迫的一种信号［10］。由表2可知，不同氮浓度对粗壮女贞叶片Pro含量影响显著。随着溶液中氮浓度的增加，粗壮女贞叶片中Pro含量呈先减少后略有增加的趋势，氮浓度为1.2 mmol/L时Pro含量最高，氮浓度为10.4 mmol/L时Pro含量最低。与最低值相比，氮浓度为1.2，5.8，15.0和19.6 mmol/L时，粗壮女贞叶片中Pro含量分别高出44.27％，36.81％，12.95％和15.22％。说明水分充足的条件下，适量增施氮肥不会对粗壮女贞造成胁迫。
2.1.4对叶片超氧化物歧化酶活性的影响
超氧化物歧化酶能够清除超氧阴离子自由基，保护植物细胞免遭过氧化损伤。逆境条件下植物的抗性与植物体内能否维持较高的SOD活性水平有关［11］。由表2可知，随着氮浓度的增加，SOD活性呈先上升后下降的趋势，并在氮浓度为15.0 mmol/L时达到最大值，比其余4个处理分别高出182.44%，75.39%，73.23%和128.24%，差异显著。随着氮浓度继续增加，SOD活性迅速下降。可见，适宜的氮素营养有利于粗壮女贞叶片中SOD活性的提高，减少活性氧对植物细胞的伤害，氮素营养不足和过高均会影响叶片中SOD活性。
2.1.5对叶片过氧化氢酶活性的影响
过氧化氢酶（CAT）主要清除植物光呼吸、线粒体电子传递以及脂肪酸β-氧化等过程中产生的H2O2，在植物的抗逆性上起着重要的作用［12］。由表2可知，粗壮女贞叶片中CAT活性在氮浓度为1.2 mmol/L时最弱，与其他各浓度间酶活性差异显著。氮浓度从1.2增加到5.8 mmol/L时，CAT活性急剧增强，可见氮素营养提高对CAT活性有显著增强作用，但之后氮浓度的增加并没显著增强或降低CAT的活性，酶活性处于稳定状态，对粗壮女贞抗逆性的增强影响也不大。
2.2氮对粗壮女贞叶片内含物含量的影响
2.2.1对叶片水浸出物含量的影响
茶叶水浸出物即茶叶中能溶于热水中的茶多酚类、游离氨基酸类、咖啡碱、维生素C等成分［13］。由表3可知，随着氮浓度的增加，粗壮女贞叶片水浸出物的含量呈先减少后增加的趋势。氮浓度为15.0 mmol/L时叶片水浸出物含量最低，分别低于其他4个处理32.87％，31.04％，20.98％和14.56％，差异显著。
2.2.2对叶片皂甙含量的影响
皂甙又称茶皂素，具有降血脂、扩充血管、降低脑血管阻力的药理作用［14］。由表3可知，随着氮浓度的增加，粗壮女贞叶片中皂甙含量呈先降低后略有回升的趋势，氮浓度为15.0 mmol/L时皂甙含量最低，分别低于其他4个处理166.80％，137.37％，130.56％和11.54％，差异显著。这说明低氮的环境对粗壮女贞叶片中皂甙的合成有显著的促进作用。
2.2.3对叶片可溶性糖含量的影响
可溶性糖含量的增加，在一定程度上可以降低酚类物质所带来的苦涩味，提高苦丁茶的品质［8］。随着氮浓度的增加，粗壮女贞叶片中可溶性糖含量整体呈起伏状降低的趋势。最大值出现在氮浓度为5.8 mmol/L时，最小值出现在氮浓度为10.4 mmol/L时，二者之间差异显著，其余3个处理之间差异不大，但高浓度氮造成了可溶性糖含量的降低。可见，可溶性糖也成为粗壮女贞渗透平衡调节物质，在低氮时，粗壮女贞依靠合成较多的可溶性糖降低水势，高氮时减少可溶性糖含量升高水势，以此来维持水势平衡。
2.2.4对叶片游离氨基酸含量的影响
氨基酸对茶叶的滋味和香气起着十分重要的作用［15-16］。由表3可知，不同氮浓度下粗壮女贞叶片中游离氨基酸总量变化并不显著，虽然随着氮浓度的增加游离氨基酸含量呈先增大后减小的趋势，但只在氮浓度为19.6 mmol/L时才有明显的降低，其余4个浓度间差异并不显著。可见，在一定的范围内，氮浓度的增加可以提高粗壮女贞叶片中游离氨基酸总量，但影响不大，过高的氮浓度影响了游离氨基酸的合成，降低了苦丁茶的营养品质。
2.2.5对叶片多酚类物质含量的影响
儿茶素类、黄酮类化合物是茶叶中可溶性多酚类化合物主要组成成分，而苦丁茶中多酚类物质含量较低，使得苦丁茶茶汤没有茶叶那样强的涩味和收敛性［17］。不同氮浓度下粗壮女贞叶片中多酚类物质含量变化不大，规律性不明显，氮浓度为5.8 mmol/L时多酚类物质含量最高，在氮浓度为10.4 mmol/L时含量最低，最高值比最低值高出36.2%，差异显著，其余处理间差异不显著。不同氮浓度处理对粗壮女贞叶片中儿茶素的影响并不明显，却对黄酮类化合物含量影响显著，但其含量与氮浓度之间没有明显的相关性。
3结论与讨论
本研究中，随着氮浓度的增加，粗壮女贞叶片中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量、和类胡萝卜素基本呈先上升后下降的趋势，氮浓度为15.0 mmol/L时，叶绿素总量较高，且达到显著水平，氮浓度为5.8 mmol/L时，叶绿素a/b的值显著低于其他浓度处理，可见适量增施氮肥能够促进粗壮女贞叶片光和色素的合成，提高光合作用的能力。粗壮女贞叶片中MDA含量都随着氮浓度增加呈先下降后上升的趋势，可见适量的氮素营养下叶片细胞膜脂过氧化程度较低，粗壮女贞植株所受伤害较小。SOD和CAT活性都随氮浓度的增加大致呈先增强后降低的趋势，氮浓度为15.0 mmol/L时SOD活性显著高于其他4个处理，氮浓度为5.8和10.4 mmol/L时也显著高于氮浓度为1.2 mmol/L时；CAT活性在氮浓度1.2 mmol/L的显著低于其他浓度处理，而其他浓度处理间差异不大。可见适量增施氮肥能促进活性酶合成，而氮肥不足或过多则会抑制活性酶合成。Pro含量呈先减少后略有增加的趋势，在氮浓度为1.2和5.8 mmol/L时显著高于其他4个处理，说明低氮环境促进了粗壮女贞积累Pro，增加了粗壮女贞对渗透胁迫的耐受性，提高了粗壮女贞对逆境胁迫的抗性。
氮素不足或过多都会对茶树品质产生极大的不良影响［18］。由表3可见，粗壮女贞叶片水浸出物和皂甙含量都随着氮浓度增加呈先降低后升高的趋势，呈正相关的关系。粗壮女贞叶片中可溶性糖含量在氮浓度为10.4 mmol/L时显著低于氮浓度5.8 mmol/L时，其他浓度下可溶性糖含量差异不显著。游离氨基酸及茶多酚含量都较低，游离氨基酸含量随着氮浓度的增加呈先升高后降低的趋势，在氮浓度为15.0 mmol/L时游离氨基酸含量最多但差异不显著，而氮浓度为19.6 mmol/L时含量降低到最少，且达到显著水平。多酚类物质在氮浓度5.8和15.0 mmol/L时含量相对其他处理较高，氮浓度为10.4 mmol/L时显著低于其他浓度的处理。粗壮女贞叶片中儿茶素含量极低，且随着氮浓度增加变化差异不大。粗壮女贞叶片中内含物含量整体呈起伏状降低的趋势，可能与粗壮女贞植株的渗透调节有关，氮素较低的环境下粗壮女贞促进叶片中内含物的合成以提高植物细胞渗透压来促进植物营养吸收，而氮素过多的环境下粗壮女贞减少内含物的含量以降低植物渗透压来避免吸收过多氮素产生毒害，这是植物细胞渗透系统的一种调节模式，但与细胞膜防御系统一样，渗透调节也有一定的调节范围，当外界损伤超过可控范围，渗透调节就失去作用，这些渗透调节的物质也会出现不规律变化。
值得注意的是，茶树叶片中儿茶素为黄烷醇的衍生物，是可溶性多酚类化合物主要成分之一，而本试验粗壮女贞叶片中黄烷醇含量极低，其主要成分还需进一步研究。
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（责任编辑 田亚玲）