封晔 FENG Ye
（贵阳职业技术学院，贵阳 550081）
摘要：采用T-RFLP法实验研究贵州省特有药用植物根际丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）的多样性。结果表明： 4种贵州省特有药用植物根际AMF种类丰富，数量较大。植物种类不同，对应的AMF群落多样性有较大差异，证明了宿主植物对根际微生物群落结构多样性的影响；同时，有机质、pH和速效磷对根际ＡＭＦ群落多样性影响较大。
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关键词 ：丛枝菌根真菌；贵州特有药用植物；群落多样性
中图分类号：S567 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2015）17-0219-02
作者简介：封晔（1981-），女，陕西绥德人，贵阳职业技术学院讲师，研究方向为微生物应用。
0 引言
贵州特有药用植物是指目前在贵州省境内发现有分布并具有药用价值，但是在贵州以外的其它地区都没有分布的物种，其代表种类有：银背叶党参、梵净山小檗、梵净山蒲儿根、梵净山冠唇花、梵净山火绒草、梵净山紫苑、短茎淫羊藿等[1]。
菌根真菌（Mycorrhizal fungi）在自然界中有着重要的生态作用，它可以与世界上大多数的维管植物根系形成互惠共生体。丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是菌根中分布最广泛的一类。研究表明，AMF因其能扩大植物根系吸收面积、加快养分运输速率、分泌活化物质、提高光合速率等直接和间接作用，改善宿主植物的矿质营养，增加植物中的碳积累，进而促进植物生长[2]。
目前对药用植物AMF的研究主要集中在菌根多样性或接种菌根真菌对植物的影响。李品明等对重庆市13种中药材植物的AMF物种多样性进行了研究，结果表明，从中药材植物根际土壤中分离出了10种菌根真菌，隶属三个科[3]。王森等以山西历山自然保护区暴马丁香、连香树、南方红豆杉和领春木4种珍稀药用植物为材料，从4种植物根际共鉴定AMF 27种[4]。在国内因药用植物种质资源丰富，宿主范围十分广泛，目前已经对上百种药用植物进行了研究。
长久以来，中药材大多来自野生药用植物，但随着对药用植物需求的不断增加，野生药用植物已经无法满足人们对药用植物的需求，甚至濒临灭绝，加之人工栽培技术落后、栽培措施不配套等原因，导致药用植物种质退化、质量下降、入药性质不稳定等。本课题主要是通过对贵州特有药用植物根际土壤采集和分析，研究药用植物根际AMF种质资源及多样性，以期为充分发掘和利用AMF资源，筛选AMF优势菌，利用菌根生物技术提高药用植物产量、品质和扩大人工栽培区提供材料和依据。
1 材料与方法
1.1 研究地概况
采样地位于贵州东南部茂兰保护区及织金县牛场镇。本区处于温暖湿润的中亚热带气候区，区域内有雷公山和月亮山，分布着适宜常绿栎林及热带常绿阔叶林生长的红壤和红黄壤，海拔最高处为2178．8m，最低处137m。区域内有中草药资源十分丰富。
1.2 样品采集
2014年10月在贵州省茂兰保护区及织金县牛场镇采集铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、黄连（Coptis chinensis Franch.）、太子参（Pseudostellaria heterophylla(Miq.) Pax）、丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）根系及根际土。每株按东西南北4个方位，除去5cm厚的表层土后，挖10～20cm深的土壤剖面，剪取带有细根的根系，用塑胶袋存放根系和根际土样品。经检测，土样基本性质如表1所示。
1.3 AMF的形态观察及其侵染能力的检测
采用Philips和Haymay染色方法进行观察和计算。
1.4 分子生物学方法分析样品多样性
1.4.1 总DNA的提取和纯化
采用Zhou 等[5]的酶裂解法提取土壤总DNA。
1.4.2 PCR扩增
采用由大连宝生物公司合成的引物AM1 和NS31扩增18SrDNA施测。反应体系为20ml.PCR扩增产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检验。
1.4.3 群落多样性分析
采用T-RFLP方法分析样品，以图谱中每一个限制性片段（T-RF） 为一个OTU，测定OTU数目即为物种丰富度指数（S），峰高值低于100荧光单位的峰不计入分析范畴。根据丰富度指数（S）和相对峰高值（Pi）测定均匀度指数（E） 和Shannon多样性指数（H）。
相对峰高值（Pi） ：Pi= ni/ N
均匀度指数（E）：E＝H/lnS
Shannon指数（H）：H＝－∑PilnPi
式中，N为该样品所有累计峰高，ni为第i个T-RF峰值。
1.5 数据分析
用表3中的实验数据代入EXCEL（2003）、SPSS（V17.0）软件系统进行汇总和分析。
2 结果与分析
2.1 根际AMF的形态及其侵染率
从表2中可见，不同宿主植物根系菌根真菌侵染率不同，四种植物中铁皮石斛的菌根侵染率最高，丹参最低。对比采样环境可以看出，侵染率与土壤性质有一定相关性。其中pH越高侵染率越高；侵染率与速效磷和速效钾呈反比。
2.2 群落多样性
2.2.1 样品总DNA提取和基因的扩增结果
从土壤中提取出的总DNA粗提样品中有大量黑褐色杂质，基因组片段大小为20 kb，用1%琼脂糖电泳检测，条带明亮齐整，这说明所得到的微生物总DNA比较完整。扩增的18 SrDNA基因片段长度为550 bp。
2.2.2 群落多样性指数
表3可见，4个样品的根际AMF多样性存在明显的差异。其中，丰富度指数和Shannon指数最高的是黄连，最低的是太子参，表明植物种类的差异对根际AMF群落多样性有影响。
3 结论和讨论
根际微生物活性及群落结构的变化是评价土壤生态系统的重要指示因子，通过观察其变化能够发现植物和土壤质量[6]。本研究表明，4种贵州省特有药用植物根际AMF种类丰富，数量较大。由于植物种类的不同，AMF群落多样性也存在很大的差异。由此可见，宿主植物也会影响根际微生物群落结构多样性。但Oehl具有不同意见，他认为土壤类型和土地利用模式决定了AMF的群落结构[8]。
对于根际微生物来说，很多的环境因子都对其群落多样性影响很大，如有机质、pH和速效磷等，这是因为土壤微生物中的养分越高，营养物质就越多，这有利于其活性的增加。卜洪震等发现使用肥料后可以促进土壤微生物的活性，并且不同施肥处理对土壤微生物量碳和微生物多样性有着重要影响[7]。本研究中速效磷是影响AMF群落多样性的一个主要因素。而从O’Donnell 等[8]学者的研究成果来看，土壤pH值也是一个重要的土壤微生物群落多样性影响因子。徐辉[9]在现有研究成果的基础上展开进一步研究，发现速效磷也直接影响刺槐和沙棘根际AMF侵染率。在自然环境中随着环境因子的变化，土壤微生物群落的形成和变化也会随之调整，这说明土壤微生物的生长和环境因子有着直接关系。通过研究土壤微生物群落动态变化，也就为了解生态系统的土壤健康状况和植被发育阶段提供了可能。
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参考文献：
[1]孙济平，何顺志.贵州特有药用植物的种类与分布[J].中国中药杂志，2005，30（10）：735-738.
[2]刘润进，陈应龙.菌根学[M].北京：科技出版社，2007.
[3]李品明，韩如刚，刘杰，等.中药材植物根际土壤VA菌根多样性研究[J].湖南农业科学，2011，3：141-142.
[4]王森，唐明，牛振川，等.山西历山珍稀药用植物AM真菌资源与土壤因子的关系[J].西北植物学报，2008，28（2）：355-361.
[5]Zhou JZ， Bruns MA， Tiedje JM.DNA recovery from soils of diverse composition. Applied and Environmental Microbiology， 1996，62（2）： 316-322.
[6]滕应，黄昌勇，骆永明，龙健，姚槐应.铅锌银尾矿区土壤微生物活性及其群落功能多样性研究.土壤学报，2004，41（1）： 113-119.
[7]卜洪震，王丽宏，尤金成，肖小平，杨光立，胡跃高，曾昭海. 长期施肥管理对红壤稻田土壤微生物量碳和微生物多样性的影响.中国农业科学，2010，43（16）：3340-3347.
[8]Oehl F， Laczko E， Bogenrieder A， Stahr K， B?sch R， van der Heijden M， Sieverding E. Soil type and land use intensity determine the composition of arbuscular mycorrhizal fungal communities. Soil Biology and Biochemistry，2010，42（5）：724-738.
[9]徐辉，唐明，高瑞霞.土壤因子对府谷清水川流域砒砂岩区刺槐和沙棘AMF的影响[J].西北植物学报，2008，28（12）：2500-2505.