摘 要：目的 探讨超声造影时间-强度曲线(TIC)参数在评估强力霉素改善失血性休克复苏期肾再灌注损伤的应用价值。方法 24只SPF级健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、失血性休克再灌注组(HS-RI组)和强力霉素干预组(Dox组),每组8只。造模结束24 h后行超声造影检查，获TIC及达峰时间(TP)、平均渡越时间(MTT)、峰值强度(Peak)、曲线下面积(AUC)定量参数；造影结束后取静脉血检测血清肌酐(Crea)及尿素氮(Urea)水平；处死大鼠取肾组织行病理检查。结果 与Sham组比较，HS-RI组Peak和AUC值增加，TP和MTT延长(P<0.05),肾脏组织损伤明显，Crea和Urea水平升高明显(P<0.05);强力霉素干预后，Peak和AUC值降低，TP和MTT缩短(P<0.05),肾脏组织损伤改善，Crea和Urea水平降低(P<0.05)。TP、MTT、Peak、AUC与Crea、Urea、MMP-2、MMP-9及TNF-α呈显著正相关(P<0.05)。结论 TIC参数可早期、敏感地监测失血性休克液体复苏期药物干预前后肾皮质灌注的变化情况，TP、MTT和AUC有一定参考价值。
关键词:超声造影;强力霉素;失血性休克;再灌注损伤;
Quantitative assessment of TIC parameters for improving renal reperfusion injury during
fluid resuscitation in hemorrhagic shock by doxycycline: an experimental study
LUO Ye LI Mingxing CHEN Xiaomei ZHU Yujie HE Jing
Department of UItrasound Medicine, The Afliated Hospital of Southwest Medical University
Abstract：Objective To analyze the correlation between TIC parameters and various laboratory indexes, and explore the value of contrast-enhanced tic parameters in evaluating the amelioration of renal reperfusion injury during resuscitation from hemorrhagic shock by doxycycline.Methods 24 healthy male SD rats were randomly divided into Sham operation group(Sham group), hemorrhagic shock reperfusion group(HS-RI group) and doxycycline group(DOX group). The quantitative parameters of time-intensity curve(TIC), time to Peak(TP), mean transition time(MTT), Peak intensity(Peak) and area under curve(AUC) were obtained 24 hours after the modeling. The serum creatinine(Crea) and Urea nitrogen(Urea) levels were detected by venous blood samples after the modeling. Kidney tissues of rats were sacrificed for pathological examination.Results Compared with Sham group, the Peak and AUC values of HS-RI group were increased, TP and MTT were prolonged(P<0.05), renal tissue damage was obvious, CREA and UREA levels were significantly increased(P<0.05). After doxycycline treatment, Peak and AUC values were decreased, TP and MTT were shortened(P<0.05), renal tissue damage was improved, and Crea and Urea levels were decreased(P<0.05). TP, MTT, Peak, AUC were significantly positively correlated with Crea, Urea, MMP-2, MMP-9 and TNF-α.Conclusion TIC parameters can provide early and sensitive monitoring of renal cortical perfusion changes before and after drug intervention in fluid resuscitation phase of hemorrhagic shock, and TP, MTT and AUC have some reference values.
Keyword：Contrast-enhanced ultrasound; Doxycycline; Hemorrhagic shock; Reperfusion;
失血性休克是临床常见的急危重症，是全身炎症和器官损伤的主要驱动因素，肾脏常因失血性休克的强烈影响造成急性肾损伤；治疗失血性休克首选方法即为补液，以便尽快恢复血容量，而肾脏损伤反而加重，这种病理现象称为失血性休克再灌注损伤(Hemorrhagic shock and reperfusion injury, HS-RI)[1]。研究[2,3]表明，强力霉素是四环素类药物，除具有抗菌作用外，也能改善失血性休克复苏后的肾损伤。本研究拟通过制备SD大鼠急性重度失血性休克液体复苏期模型，使用超声造影TIC参数评估强力霉素改善失血性休克复苏期再灌注损伤后肾皮质血流灌注的改变，分析TIC参数与实验室指标的相关性，探讨TIC参数在评估强力霉素治疗肾HS-RI的应用价值。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
SPF级雄性SD大鼠24只，8～10周龄，体质量(300±50)g, 由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(川)2020-03,于恒温动物房(25℃)适应性喂养7天，自由进食饮水，术前6 h禁食禁饮。随机将大鼠分为假手术组(Sham组)、失血性休克再灌注组(HS-RI组)和强力霉素干预组(Dox组),每组8只。Dox组于术前30 min给予10 mg/kg强力霉素经尾静脉注入，Sham组及HS-RI组注入等量生理盐水。本研究获得医院伦理委员会批准。
1.2 动物模型建立
腹腔注射肝素钠溶液 (10 mg/kg) 全身肝素化，15 min后腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，颈部及右侧腹股沟区备皮，仰卧位固定，用镊子牵出鼠舌，防止舌后缀，碘伏消毒备皮区域。沿颈部正中切开皮肤，逐层钝性分离，游离出左侧颈总动脉，置入20G 留置针并固定，经三通管连接生物多导生命监测仪，待显示屏上血压曲线稳定时，记录此时的数值作为原始平均动脉压(Mean arterial pressure, MAP)。以同样的方法分离出右侧股总动脉，置入24G留置针作为放血通道，放血至40% MAP,维持 1 h, 建立重度失血性休克定压模型，左侧股总静脉置入24G留置针作为补液通道，复苏液为2:1的乳酸钠林格注射液和羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液，通过补液通道输入复苏液至血压回升至80%MAP,再灌注模型建立成功，拔管、结扎血管，缝合皮肤，术后大鼠清洁饲养，自由饮水进食。Sham组未行放血及补液处理，其他手术操作与两组相同。
1.3 超声造影检查
所有大鼠于术后24 h后水合氯醛麻醉，右侧肾区及左侧腹股沟区剃毛并固定。分离出左侧股总静脉并置入24G留置针，建立推注超声造影剂通道。采用Siemens ACUSON S3000 超声诊断仪，9L4变频线阵探头，在二维模式下扫查右肾，将探头置于最大冠状切面，转换为造影模式，设置相关参数：频率5.0MHz, 深度4.0 cm, 机械指数(MI)0.07,超声造影剂采用sonovue, 使用5 mL生理盐水配置成六氟化硫(SF6)微泡混悬液，经左侧股总静脉置管按0.4 mL/kg剂量团注，随即注入0.5 mL生理盐水冲管，连续观察右肾造影3 min, 并保存动态图像。通过超声诊断仪内置分析软件(Auto tracking contrast quantification, ACQ)进行定量分析，选取同一深度、与声束垂直、面积为0.05 mm2的肾皮质区中份为感兴趣区域(ROI),绘制时间-强度曲线(Time-intensity curve, TIC)并获取相关参数，包括峰值强度(peak intensity, Peak)、达峰时间(Time to peak, TP)、曲线下面积(Area under the curve, AUC)及平均渡越时间(Mean transition time, MTT)。所有参数由同一操作者测量3次，取平均值。
1.4 肾功能检查
超声造影结束后，通过下腔静脉取血3 mL,离心后取上层血清，用于检测血肌酐(Creatinine, Crea)及尿素氮(Urea nitrogen, Urea)水平。
1.5 病理学检查
取血结束后，经左侧股总静脉置管注入空气处死大鼠，迅速取大鼠右肾组织，沿冠状面均分为两份，一份用10%中性甲醛固定液固定，石蜡包埋，切片后行HE染色，镜下观察病理形态改变；另一份用ELISA法检测基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)及肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。
1.6 统计学分析
采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，服从正态分布的计量资料以(x¯±s)表示。组间各指标的比较采用单因素方差分析，运用Pearson相关性分析评价TIC参数与实验室指标之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠超声造影TIC及相关参数比较
通过对3组大鼠超声造影绘制TIC整体分析可见，Sham组TIC上升快速达峰，达峰后快速下降至基础水平；HS-RI组及Dox组TIC上升至峰值及下降较Sham组明显减慢；Dox组TIC较HS-RI组上升及下降均有明显增快，见图1。与Sham组比较，HS-RI组和Dox组的Peak、AUC增加，TP、MTT延长(P<0.05);与HS-RI组比较，Dox组Peak、AUC减小，TP、MTT缩短(P<0.05),见表1。
2.2 各组大鼠肾功能结果比较
与Sham组比较，HS-RI组和Dox组的血Crea及Urea水平升高(P <0.05);与HS-RI组比较，Dox组Crea及Urea水平降低(P<0.05),见表2。
2.3 各组大鼠肾组织MMP-2、MMP-9和TNF-α水平
与Sham组相比，HS-RI组和Dox组大鼠肾组织匀浆中的MMP-2、MMP-9及TNF-α水平升高，除Dox组中的MMP-9水平比较差异无统计学意义，余指标经较差异均有统计学意义(P<0.05)。与HS-RI组相比，Dox组中的MMP-2、MMP-9及TNF-α水平降低(P<0.05)。见表3。
2.4 TIC参数与实验室指标相关性分析
TP、MTT及AUC与Crea、Urea、MMP-2及TNF-α呈高度正相关(P<0.05);TP、MTT及AUC与MMP-9呈中度正相关；Peak与Crea、Urea、MMP-2、MMP-9及TNF-α呈中度正相关(P<0.05),见表4。
2.5 病理结果
Sham组肾皮质肾小球结构完整清晰，肾小管排列整齐，未见变性或坏死，间质无异常改变；HS-RI组部分肾小管上皮细胞肿胀、坏死，局部肾小管内可见蛋白管型，间质内可见少许炎细胞浸润；Dox组部分肾小管上皮细胞肿胀、空泡样变，间质偶见少许炎细胞浸润，见图2。
3 讨论
失血性休克是一种低血容量性休克，全球每年估计有190万人死亡，其中150万人死于身体创伤，导致休克的出血原因差异很大，包括创伤、产妇出血、胃肠道出血、围手术期出血和动脉瘤破裂等[4]。尽管通过液体复苏恢复了血流动力学，但失血性休克和复苏后可能发展为系统性炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS),导致多器官损伤和功能障碍即多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)。肾脏血供丰富，缺乏侧枝循环，再灌注过程更易损伤。肾脏血流动力学的改变可影响肾功能，肾皮质的血流灌注量占肾血流量的90%,因此检测肾皮质血流灌注的变化可以间接反映肾损伤程度[5,6]。超声造影技术能动态检测宏观血流及微循环改变[7],目前有许多文献报道了超声造影技术鉴别在甲状腺结节、肝肿物、前列腺结节等良恶性的应用，超声造影能显示肿瘤内微血管的分布图像，获得关于细小血管的相关信息[8,9,10]。超声造影剂SonoVue主要成分是SF6微泡，直径1～5 μm, 不含人体蛋白成分，在血液中稳定性好，能进入各组织器官的毛细血管网，不进入组织间隙，15 min几乎全部经呼吸排除，不经肝肾代谢，无肝肾禁忌，是理想的血池显像剂。与核医学、MRI及CT等检查技术比较，超声造影技术评估组织血流灌注具有操作简单、重复性好、费用低、无放射性及肾毒性等优势。
TP反映造影剂开始注入至峰值强度的时间，MTT反映了造影剂开始注入至廓清到峰值强度一半的时间。HS-RI的主要机制与炎症反应、细胞凋亡、微循环障碍、钙超载等有关[11,12,13,14],HS-RI发生后在过量的氧自由基、TNF-α、IL1-β等诱发下，内皮细胞、成纤维细胞及白细胞等细胞内MMP-2和MMP-9表达上调，导致毛细血管内皮功能障碍、破坏毛细血管基底膜与内皮细胞的紧密连接及降解细胞外基质，使血浆向组织间隙渗出，引起血液浓缩，造成血流的粘滞状态[15,16,17];同时MMP-2和MMP-9进一步激活的炎症因子如IL-1、TNF-α、TGF-β等大量释放，加剧炎症反映，导致内皮细胞上黏附大量白细胞，引起肾皮质微循环障碍[18],造成了肾皮质血流灌注减慢。因此超声造影微泡在肾皮质中的灌注速度和廓清速度减慢，在TIC参数上表现为TP与MTT延长。AUC是反映ROI内一段时间内的造影剂累积总积分值，HS-RI导致大量炎症细胞淤积于毛细血管内，炎症细胞对造影剂微泡有一定的吞噬作用，被吞噬的造影剂保持声学活性可被检测，而且造影剂微泡廓清速度的减慢，因此TIC参数表现为AUC值增大[19]。Peak代表了ROI中造影剂达到峰值时的信号强度，与造影剂微泡的灌注速度、廓清速度及炎症细胞的吞噬作用有关，在TIC参数中Peak值也表现为增大。研究表明，作为外源性的基质金属蛋白酶抑制剂，强力霉素可以改善肾HS-RI引起的炎症反应、氧化应激及细胞凋亡，最重要的是能降低MMP-2和MMP-9的含量与活性[20,21,22]。Peak值作为反映造影剂达到峰值时的信号强度的瞬时指标，无不明显累积效应，不能较好反映药物干预前后肾皮质血流灌注的改变，因此Peak值不能作为评估肾皮质血流灌注变化的参数[23]。强力霉素对MMP-2和MMP-9的抑制可以改善内皮细胞功能障碍、维持毛细血管基底膜完整及降低微循环阻力，使得肾皮质血流灌注得以改善，因此造影剂微泡在肾皮质中的灌注及廓清速度增快，在Dox组TIC参数上表现为TP和MTT缩短，同时强力霉素能改善炎症反应，降低炎症细胞对超声造影剂的吞噬作用，故在TIC参数上表现为AUC及Peak值的降低。本研究结果表明，HS-RI组大鼠肾皮质血流灌注出现明显改变，与Shams组相比，在TIC参数上表现为TP、MTT延长，Peak、AUC增加，这与孙晓颖等[24] 的实验结果一致。
血清Crea和Urea指标作为临床工作中常用的评估肾脏功能指标，但肾脏的代偿能力强，在肾损伤早期Crea和Urea依然能维持在正常水平[25] 。超声造影可以更敏感、精确地反映急性肾损伤早期肾脏血流灌注状态，因此超声造影相关参数在肾损伤早期就会出现改变[26],在反映肾功能改变较血清Crea和Urea具有更高灵敏度。本研究中HS-RI组病理组织切片表现为部分肾小管上皮细胞肿胀、坏死，蛋白管型及炎细胞浸润，血清Crea及Urea水平较Sham组明显升高(P<0.05),肾组织匀浆中MMP-2、MMP-9及TNF-α水平也较Sham组升高(P<0.05);Dox组病理表现为部分肾小管上皮细胞肿胀、空泡样变，偶见少许炎细胞浸润，Crea、Urea、MMP-2、MMP-9及TNF-α等指标较HS-RI组显著改善(P<0.05)。病理及实验室指标结果证实强力霉素对失血性休克液体复苏后的肾再灌注损伤有保护作用。将TIC参数与Crea、Urea、MMP-2、MMP-9及TNF-α等指标进行Pearson相关性分析发现，各TIC参数与肾功能指标Crea及Urea呈显著正相关(P<0.01),即Crea及Urea值越高，各TIC参数值越大；各TIC参数与MMP-2、MMP-9及TNF-α也呈显著正相关(P<0.01),即MMP-2、MMP-9及TNF-α值越高，各TIC参数值越大，这表明各TIC参数与各实验室指标间具有很强的平行性，TIC参数能在一定程度上反映肾功能变化。
有研究[2]报道，强力霉素在急性失血性休克液体复苏之前和之后给予有相似的保护作用，具有减轻出血后肾损害的临床疗效。在本研究中，强力霉素在复苏前给予，实验结果也显示了强力霉素对肾脏的保护作用。本实验不足之处：①动物样本量相对较少。②本实验通过麻醉及全身肝素化建立的重度失血性休克液体复苏模型与实际临床情况有所出入。③仅选择24 h一个时间点作为研究较为局限。目前这类实验研究较少，若想确定诊断肾功能损伤程度的TP、MTT及AUC的有效阈值，则还需进一步的研究。
4 结论
强力霉素可以减轻失血性休克液体复苏后肾功能损伤，改善肾皮质血流灌注，超声造影TIC参数如TP、MTT与AUC可定量评估药物干预前后肾皮质血流灌注变化情况，有望为临床早发现、早干预该类疾病提供一种新的方法。
参考文献
[1] HUJ B,LI S J,KANG X Q,et al.CD44-targeted hyaluronic acid-curcumin prodrug protects renal tubular epithelial cell survival from oxidative stress damage[J].Carbohydr Polym,2018, 193:268-280.
[2] KHOL MUKHAMEDOV A,CZERNY C,HU J,et al.Minocycline and doxycycline but not tetracycline ,mitigate liver and kidney injury after hemorrhagic shock/resuscitation[J] .Shock,2014. 42(3):256-263.
[3] ORTES A L,GONSALEZ S R,RIOJAL S,et al.Protective outcomes of low-dose doxycycline on renal function of Wistar rats subjected to acute ischemia/reperfusion injury[J] .Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis ,2018,1864(1):102-114.
[4] CANNON J W.Hemorrthagic Shock[J].N Engl J Med,2018,378(4):370-379.
[5] FISCHER K,MERAL F C,ZHANG Y,et al.High-resolution renal perfusion mapping using contrast-enhanced ultrasonography in ischemia-reperfusion injury monitors changes in renal microperfusion[J].Kidney Int,2016 89(6):1388-1398 .
[6] WEI K,LE E,BIN J P,et al.Quantification of renal blood flow with contrast-enhanced ultrasound[J].J Am Col Cardio ,2001 ,37(4):1135-1140.
[7] LAMBY P,PRANTL L,KRUGER-GENGE A,et al. Influence of ultrasound microbubbles on kidney oxygen tension[J].Clin Hemorheol Microcirc,2017,67(3-4):211-214.
[8]赵恒达，王怡甲状腺良恶性结节SWE技术参数与超声造影参数的相关性及联合诊断价值分析[J]影像科学与光化学，2021,39(4):526-532.
[9]刘倩，红华，杨敬春，等.前列腺良恶性病变超声造影参数与VEGF. TGF-β1相关性的初步研究[J]中国医疗设备，2019,34(4):95-99.
[10]刘志龙，张超，严继萍，等. 常规超声及超声造影对肝局灶性结节性增生的诊断价值[J].临床肝胆病杂志，2020,36(9):2056 -2058.
[11] YANG M,LINN B S,ZHANG Y,et al.Mitophagy and mitochondrial integrity in cardiac ischemia-reperfusion injury[J] Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 2019,1865(9):2293-2302.
[12] AKBARI G .Role of Zinc Supplementation on Ischemia/Reperfusion Injury in Various Organs[J] Biol Trace Elem Res,2020,196(1):1-9.
[13] PEFANIS A,IERINO F L,MURPHY J M,et al. Regulated necrosis in kidney ischemia-reperfusion injury[J]. Kidney Int,2019,96(2):291-301.
[14] RAHMANIA L,ORBEGOZO D,SU F,et al. Administration of Tetrahydrobiopterin (BH4) Protects the Renal Microcirculation From Ischemia andReperfusion Injury[J] Anesth Analg,2017,125(4):1253-1260.
[15] CAVDAR Z,URAL C,CELIK A.et al.Protective effects of taurine against renal ischemia/reperfusion injury in rats by inhibition of gelatinases,MMP-2 and MMP-9,and p38 mitogen-activated protein kinase signaling[J] Biotech Histochem,2017.92(7):524-535[16] ROSSI H S,KOHO N M,ILVES M,et al.Expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer and matrix metalloproteinase-2 and -9 in horses with chronic airway inflammation[J].Am J Vet Res ,2017,78(11):1329-1337.
[17]刘恒，陈晶，李晓华,等缺氧缺血性脑病新生儿血清MMP-9、MMP -2动态变化及意义U]临床儿科杂志，2009.27(9):842. 845.
[18] CATANIA J M,CHEN G,PARRISH A R.Role of matrix metalloproteinases in renal pathophysiologies[J].Am J Physiol Renal Physiol,2007 ,292:F905-F911.
[19]实，贾化平，梁会泽,等超声造影时间-强度曲线对急性肾损伤的诊断价值[J]中国超声医学杂志， 2017,33(9);:833-836.
[20] KUCUK A,KABADERE S,TOSUN M,et al.Protective effects of doxycycline in ischemia/reperfusion injury on kidney[J]J Physiol Biochem,2009,65(2):183-191.
[21]钱清富，薛恩生,陈志奎，等超声造影评价基质金属蛋白酶抑制剂对睾丸缺血再灌注损伤的保护作用[J]中华超声影像学杂志，2018,27(3):265-269.
[22] FATIH YASAR N,OZDEMIR R,IHTIYAR E,et al. Effects of doxycycline on intestinal ischemia reperfusion injury induced by abdominal compartment syndrome in a rat modl[J]. Curr Ther Res Clin Exp ,2010,71(3):186-198.
[23]曾祯，胡经纬，李璇，等超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]中国组织工程研究，2021,25(8):1201-1206.
[24]孙晓颖，邝斌，罗志建，等超声造影在评价地塞米松改善大鼠肾缺血再灌注损伤中的应用价值[J]实用医学杂志，2019,35(7):1069-1072.1078.
[25]陈静，王燕，胡龙妃，等血清胱抑素C、血肌酐及血尿素氮对窒息新生儿肾功能损害的临床意义[J.现代生物医学进展，2019,19(13):2547-2550.
[26] 左董，孙虎，拜合提尼沙吐尔地.肾皮质超声造影定量分析可预测脓毒症发生急性肾损伤的风险[J].内科急危重症杂志，2021.27(4)-:294-298.