自体多免疫细胞疗法联合恩替卡韦治疗慢性乙型活动性肝炎的短期疗效观察

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更新时间2016-04-02
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多免疫细胞疗法是一群具有较强免疫活性的细胞联合治疗相应疾病的简称，主要包括病毒特异性CTL、NK细胞、γδT细胞、NKT细胞等多种细胞。其中NK细胞与NKT细胞是肝脏固有免疫应答反应中的主要淋巴细胞，这两种细胞约占肝脏淋巴细胞的50%。当HBV急性感染时，肝脏内的NKT能直接激活细胞防御基因家族，诱导β干扰素的分泌，直接抑制病毒DNA复制[1-4]。γδT细胞介于固有和适应性免疫的T细胞，是免疫防御的第一防线，具有免疫调节、参与多种细菌与病毒的免疫应答等作用[5]。提高机体的T淋巴细胞和抗原提呈细胞的细胞免疫功能及增加协同细胞因子等多种方法联合对于清除病毒、打破免疫耐受将起到重要的作用[6]。恩替卡韦（entecavir，ETV）是目前最常用的核苷酸类抗病毒药物，由于具有抗病毒效果迅速、耐药率低等特点而广泛应用于临床[7]。但核苷类似物只能抑制HBV DNA复制，并不能彻底清除乙肝病毒[8]，致使患者需要多年服用抗病毒药物。多种免疫细胞，对于提高患者固有免疫和针对HBV的特异性免疫功能有帮助，与恩替卡韦联合应用，有可能促进HBV的清除。本研究收集自体多免疫细胞联合恩替卡韦治疗慢性乙型活动性肝炎患者资料，与单用恩替卡韦治疗为对照，初步分析疗效、不良反应等临床资料，现将前期研究结果报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 临床资料
　　选择2015年4～9月我院收治的慢性活动性乙型病毒性肝炎患者26例，符合“2012年中华医学会肝病学分会、感染病学分会制定的《乙型肝炎防治指南》”中的诊断标准和抗病毒治疗适应证，排除非活动性HBsAg携带者/慢性HBV携带者、合并其他肝损疾患（其他嗜肝病毒重叠感染、药物性、酒精性、自身免疫性、代谢性等）、失代偿期肝硬化、肝功能衰竭、活动性出血、重要脏器功能障碍、出凝血功能障碍、妊娠、正在使用免疫抑制药物，或器官移植后长期使用免疫抑制剂等患者。经知情告知，患者自主选择，分为恩替卡韦、自体多免疫细胞联合治疗组12例，男10例，女2例，年龄（37.41±7.54）岁；单用恩替卡韦对照组（ETV组）14例，男12例，女2例，年龄（35.36±8.26）岁。两组患者在性别、年龄方面比较，无统计学差异，见表1。
　　表1 两组患者一般资料比较
　　1.2 方法
　　1.2.1 治疗方法两组患者均符合抗病毒治疗适应证，经知情告知，患者均选择恩替卡韦分散片（正大天晴药业有限公司，0.5 mg/片：国药准字H20100019）0.5 mg口服，1次/d，抗病毒治疗。
　　1.2.2 观察指标两组患者在抗病毒治疗前1～3 d晨起空腹采血检测血常规、生化、乙肝三系、HBV DNA等指标，联合治疗组患者同时机采外周血150 mL进行分离、定向培养。治疗后8～12周对两组患者上述指标进行复检。
　　1.2.3 自体多免疫细胞分离、培养、回输操作方法
　　1.2.3.1 单核细胞的分离机采患者外周血150 mL，转入50 mL离心管，离心2000 rpm，10 min，吸取血浆等分为6份，冻存于-80℃冰箱，供回输细胞时使用；预先将淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque1077，加入50 mL无菌离心管，20 mL/管（分离单个核细胞）；吸取生理盐水将吸取血浆后的标本还原至原始体积，混匀，缓慢加在Ficoll-Hypaque1077上，体积比为1∶1～1.5。600 rpm，室温离心20 min（注意调整离心机加速和减速过程为最低）；用平口巴氏滴管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁吸取该层，每管加生理盐水至50 mL，轻轻吹匀细胞，离心洗涤3次，除去血小板和分离介质。弃去上清，用无血清1640培养液重悬计数；将分离得到的单核细胞进行分成3份，分别用作γδT细胞、NK细胞、NKT细胞的培养。
　　1.2.3.2 γδT细胞的培养取1.2.3.1步骤获得的PBMC细胞一份，以细胞浓度1×106/mL加入适量细胞培养基，并加入预刺激因子：A1、自体血浆10%；在培养的第2天加入A2和A3，第3天再加入A4，3 d以后视培养情况补液或传代，第13天收集细胞，生理盐水洗涤3次，用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬浮，总体积为200 mL，静脉回输患者，第1天回输共2次。
　　1.2.3.3 NK细胞的培养取1.2.3.1步骤获得的PBMC细胞一份，以细胞浓度1×106/mL加入适量细胞培养基，并加入预刺激因子：E1、自体血浆10%；在培养的第2天加入E2，第3天再加入E3、E4、E5，3 d以后视培养情况补液或传代，第14天收集细胞，生理盐水洗涤3次，用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬浮，总体积为200 mL，静脉回输患者，第2天回输共2次。
　　1.2.3.4 NKT细胞的培养取步骤1.2.3.1 PBMC细胞一份，以细胞浓度1×106/mL加入适量细胞培养基，并加入预刺激因子：B1、自体血浆10%；在培养的第2天加入B2，第3天再加入B3、B4，3 d以后视培养情况补液或传代，第15天收集细胞，生理盐水洗涤3次，用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬浮，总体积为200 mL，静脉回输患者，第3天回输共2次。
　　1.2.3.5 细胞的质量控制细胞培养至第7天，取样进行细菌学培养；每次回输前1 h通过凝胶法进行细菌内毒素检查。细胞2℃～6℃冷链运输，2 h内回输患者体内，并记录每次输注细胞后有无寒战、发热及过敏等症状。
　　1.2.3.6 细胞回输过程中的护理制备好的细胞悬液灌装于生理盐水中，体积为100 mL，用一次性输血器静脉滴注，速度40滴/min，为避免细胞堵塞输血器管腔或黏附管壁，输注完毕后用20 mL生理盐水冲洗输液瓶和管道。在细胞输注过程中，由专职护士全程负责，严格遵守无菌技术操作原则，如有不良反应，及时汇报医生处理。