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探讨Notch信号通路对糖尿病大鼠血管平滑肌细胞mRNA影响

  • 投稿为领
  • 更新时间2015-10-29
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孟凡兵1 范东旭2 刘 丽3 金 松2

1 吉林省长春市解放军461 医院 吉林省长春市 130000

2 黑龙江省佳木斯市佳木斯大学附属第一医院 血管外科 黑龙江省佳木斯市 154007

3 黑龙江省人民医院 血管外科 黑龙江省 哈尔滨市 154000

【摘 要】目的:探讨Notch 信号通路对体外培养糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的mRNA 水平的影响。方法:本课题从不同梯度浓度γ- 分泌酶抑制剂(DAPT) 干预Notch 信号通路后对DM 大鼠VSMCs 基因影响进行论述。结果:通过实时定量PCR 方法分析得出,加γ- 分泌酶抑制剂(DAPT) 的培养基的 DM 大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs) 溶解温度峰值Tm 进行检测得出:溶解曲线呈单峰,溶解温度在86.0℃ -84.0℃之间,溶解温度变化小,表明为特异性扩增。结论:实验结果显示DAPT 干预Notch 信号通路后,对体外培养的DM 大鼠VSMCs 的mRNA 有抑制趋势,复制率下降,使其溶解温度峰值前移,溶解曲线呈单峰,将会导致进一步细胞凋亡。

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关键词 PCR;糖尿病大鼠;DAPT;血管平滑肌细胞;mRNA

1 材料与方法

本课题前期的糖尿病大鼠模型建立、糖尿病大鼠主动脉血管病变检测、糖尿病大鼠VSMCs 体外培养及鉴定以及不同梯度浓度γ- 分泌酶抑制剂(DAPT) 干预Notch 信号通路后对DM 大鼠VSMCs 活性及毒性、凋亡、细胞周期的影响均已完成,且DM 大鼠VSMCs 已完成冻存。仅从不同梯度浓度γ- 分泌酶抑制剂(DAPT) 干预Notch 信号通路后对DM 大鼠VSMCs 基因影响进行论述。

1.1 实验对象

取已完成的糖尿病大鼠血管平滑肌细胞,进行细胞复苏与传代。

1.1.1 VSMCsmRNA 的抽提

取冻存已裂解的细胞,在常温下放置到完全溶解。溶解RNA 时,先加入无RNA 酶的水40μl 用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA 溶液保存于-80℃,作为实时定量PCR 扩增实的模版。

1.1.2 RNA 质量检测,紫外吸收法测定取少量RNA 溶液用TE 稀释(1:100)后,读取260nm 和280nm 两处的吸收值,测定RNA 溶液的浓度和纯度。进行浓度测定, 在进行纯度检测,mRNA 纯度为mRNA 溶液的A260/A280 的比值,比值范围1.9 到2.1.

2 反应条件

如表1。

3 引物设计软件

Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补。

根据文献设计出相应的引物。

目标基因:

上游引物为5 ' : TTA TTA GAG GGTGGG GCG GAT CGC TAT 3 '下游引物为5 ':GAC GAC CCCGAA CCG CGA CCG TAA CAG 3 '扩增条目的条带大小为155bp。对照基因:

上游引物5 ' : TTA TTA GAG GGTGGG GTG GAT TGT TAT3 '下游引物5 ': CAA GAC CCC GAACCG CGA CCG ATA CCA3 '扩增条目的条带大小为156bp。

4 结果

通过实时定量PCR 方法分析得出,加γ- 分泌酶抑制剂(DAPT) 的培养基的DM 大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs) 溶解温度峰值Tm 进行检测看见:溶解温度在86.0℃——84.0℃之间,溶解温度单一,溶解曲线呈单峰,标明为特异性扩增。而对照组(正常培养基)未见特异性峰值。从PCR 溶解曲线我们看见DAPT 干预Notch信号通路后对体外培养的DM 大鼠VSMCs的mRNA 有抑制趋势,使其溶解温度峰值前移,溶解曲线呈单峰,复制率下降,将会导致细胞凋亡。

5 结论

本课题通过实时定量PCR 技术分析探讨Notch 信号通路在糖尿病大鼠血管再生及成熟中的作用机制,分析探讨Notch 信号通路对体外培养糖尿病大鼠血管平滑肌细胞的mRNA 水平有何影响,为进一步研究糖尿病患者血管再生提供依据,有可能成为获得更多有功能的血管以促进血管新生,为临床治疗糖尿病足溃疡、缺血性疾病、改善预后提供新思路和新途径,并为以后系统科学地研究血管再生提供方向,为缺血性疾病的治疗提供靶向药物,希望在不久之后会应用到临床治疗中,造福广大糖尿病足溃疡、缺血性疾病患者,实现从实验室到临床的完整对接,进一步提升糖尿病足溃疡、缺血性疾病治疗的基础研究水平。

(通讯作者:金松)

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