靳宝芬 吴国丽 赵正保
山西医科大学药学院，山西太原030001
[摘要] 目的 观察4-氨基水杨酸(4-ASA)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞一氧化氮(NO)的生成及诱生型一氧化氮合酶(iNOS)基因和蛋白表达的作用。方法 采用LPS诱导RAW264.7细胞建立细胞炎症反应模型，加入不同浓度的4-ASA，采用一步法测定细胞上清中NO释放量；采用实时定量PCR法测定iNOSmRNA的表达；采用Western blot法测定目的蛋白iNOS的表达。结果 100 μg/mL和1000 μg/mL4-ASA能明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的分泌及iNOS基因和蛋白的表达（P＜0.05）。结论 4-ASA可明显降低LPS 诱导的RAW264.7细胞NO的产生以及iNOS基因和蛋白的表达，从而发挥抗炎作用。
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关键词 4-氨基水杨酸；脂多糖；RAW264.7；一氧化氮；诱生型一氧化氮合酶
[中图分类号] R285.5[文献标识码] A[文章编号] 1674-074２（２０１4）04（c）－０134-02
[基金项目] 山西省留学人员科研资助项目（2011-047）。
[作者简介] 靳宝芬（1990.1-），女，山西晋中人，硕士（在读），研究方向：炎症性肠病的药物研究，E-mail：sxjinbaofen@126.com。
[通讯作者] 赵正保，男，山西运城人，教授，硕士生导师， 研究方向：炎症性肠病的药物研究，E-mail： zhengbao_z@163.com。
5-氨基水杨酸( 5-aminosalicylic acid， 5-ASA)及其前药被广泛用于溃疡性结肠炎(ulcerative colitis， UC)的治疗[1]，而4-氨基水杨酸(4-aminosalicylic acid， 4-ASA)是5-ASA的同分异构体，有报道称[2-4]，传统用于抗结核病的药物4-ASA在UC治疗上与5-ASA有相近的疗效，临床研究显示：即使大剂量使用，不良反应相对较小，且患者耐受性较好。且与5-ASA相比，结构相对稳定，较易合成，价格远低于5-ASA。但其抗UC机制不明，限制了4-ASA在临床上的广泛应用。该课题目的在于研究4-ASA对LPS诱导的炎性小鼠巨噬细胞株RAW264.7分泌NO的抑制作用及其发挥抗炎作用可能的作用机制，这将为4-ASA抗UC作用机制的研究及广泛应用于临床提供基础。
1 材料与方法
1.1 试剂
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株，上海细胞库；4-氨基水杨酸、脂多糖（LPS），Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒、β-Actin一抗、武汉博士德生物工程有限公司；iNOS一抗，Santa公司；NO试剂盒，南京建成生物工程研究所；β-Actin、iNOSmRNA引物，上海生物工程有限公司；Super-Script TM III 反转录试剂盒，Invitrogen公司；SYBRPremix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒，TAKARA公司。
1.2 细胞培养
RAW264.7细胞常规培养于含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100U/ml的DMEM高糖培养基中。培养环境为37 ℃、含5% CO2的恒温培养箱，2~3 d传代1次。
1.3 一步法检测细胞上清NO含量
对数生长期RAW264.7细胞按1×106个/mL接种于96孔板，贴壁后，弃培养基，分别给予造模或药物处理，设立正常组（无血清培养基）、LPS模型组（含1 μg/mL LPS的无血清培养基）、4-ASA高剂量组（含1 000 μg/mL 4-ASA的无血清培养基）、模型+4ASA低剂量组（含1 μg/mL LPS、10 μg/mL 4-ASA的无血清培养基）、模型+4ASA中剂量组（含1 μg/mL LPS、100 μg/mL 4-ASA的无血清培养基）和模型+4ASA高剂量组（含1 μg/mL LPS、1 000 μg/mL 4-ASA的无血清培养基），每组设3个复孔，培养箱培养12 h后，收集各孔细胞上清液，按NO试剂盒说明书操作，在530 nm波长条件下，读取各孔吸光度值，计算NO含量。
1.4 real time PCR法检测细胞iNOS mRNA表达
细胞按1×106/mL接种于6孔板，处理方法同1.3，收集细胞，Trizol法提取总RNA。以总RNA为模板，反转录反应得到cDNA，按照实时定量PCR试剂盒操作说明配制反应体系，反应条件：95 ℃预变性15 min后，95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃34 s，反应40个循环。目的基因及内参基因上下游引物为：iNOS上游引物5’-CACCTTGGAGTTCACCCAGT-3’，iNOS下游引物5’-ACCACTAGTACTTGGGATGC-3’； β-actin上游引物5’-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3’，β-actin下游引物5’-TCTGCATCCTGTCAGCAATG-3’，得到各目的基因及内参基因的循环阈值(Ct)，利用公式2ΔΔCt进行相对定量分析。
1.5 Western Blot法检测iNOS蛋白表达
细胞处理方法同1.4，处理后，冰PBS冲洗2次，每孔加1 ml细胞裂解液，冰浴晃动30 min，收集并置于95℃水浴处理10 min，12 000×g离心10 min，取上清。按蛋白浓度测定试剂盒说明操作，测定总蛋白浓度。每孔加15 μg蛋白样品进行Western Blot，以β-actin为内参，检测各样品中iNOS的蛋白表达。
1.6 统计方法
实验数据以mean±SD表示，采用统计软件SPSS16.0进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，检验水准α= 0.05。
2 结果
2.1 4-ASA对LPS诱导的RAW264.7炎性细胞释放NO的影响
与正常组相比，模型组细胞上清液中NO浓度显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。4-ASA组（1000 μg/mL）细胞上清液中NO浓度与正常组无统计学差异。与模型组相比，造模后给予4-ASA处理组（10、1 000、1 000 μg/mL）细胞上清液中NO浓度明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。
2.2 4-ASA对LPS诱导的RAW264.7炎性细胞iNOS mRNA及蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组细胞内iNOSmRNA和蛋白表达均显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。4-ASA组（1 000 μg/mL）细胞iNOSmRNA表达和蛋白表达均与正常组差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组相比，造模后给予10 μg/mL 4-ASA处理组的细胞iNOSmRNA表达和蛋白表达均未见明显下调，而给予100 μg/mL和1 000 μg/mL 4-ASA处理组的细胞iNOSmRNA表达和蛋白表达均明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1、2。
3 讨论
UC是以大量炎症细胞浸润，肠道炎症损伤为主要表现的慢性炎症性疾病。目前，NO自由基在UC发病机理中的作用已成为研究的重要课题，有文献报道[5]，UC患者血清NO浓度高于正常人，且与疾病活动度呈正相关。在UC不同的病变程度下，NO含量随着病情的加重而升高，提示NO自由基参与UC的病理过程。NO是由组织内源性一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成的，NOS分为两型：原生型(cNOS)和诱生型(iNOS)。UC患者及小鼠模型结肠黏膜层中iNOS显著升高，分布于巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞中[6-7]。也有研究发现，UC大鼠结肠黏膜中iNOSmRNA表达明显高于对照组[8]，提示iNOS与UC发病有关。在课题前期的CCK-8实验中，已证实1000μg/ml浓度范围内的4ASA对RAW264.7细胞株无生长抑制作用，该实验结果证实，100 μg/mL及1 000 μg/mL浓度的4-ASA可抑制LPS造模后炎性小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中NO的产生，iNOSmRNA及iNOS蛋白的产生，证实4-ASA对炎性RAW264.7细胞中NO产生的抑制作用是通过抑制iNOS的合成而发挥的。该实验通过研究4-ASA对炎性巨噬细胞产生NO的影响，为进一步研究4-ASA发挥抗UC作用的作用机制研究提供依据。
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参考文献
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（收稿日期：2014-01-16）