谭 文1 贾晓敏2
1.长沙市第八医院病理科，湖南长沙 410000；2.湖南省人民医院病理科，湖南长沙 410000
[摘要] 目的 探讨了不同的抗原修复方法对肾活检标本石蜡切片免疫荧光染色的影响。方法 选取该院30例肾活检标本作为研究对象，随机分成对照组与研究组，对照组采用冰冻切片方法，研究组采用石蜡切片方法，其中分成应用无抗原修复组、胰酶抗原修复组、高压加热抗原修复组，均进行免疫荧光染色。分析和对比研究组与对照组标本的免疫荧光染色结果。结果 研究组中的胰酶抗原修复组与对照组的免疫荧光染色结果基本相同（P＜0.05）；研究组中高压加热抗原修复组的假阴性明显高于对照组（P＜0.05），研究组中无抗原修复组的染色效果比对照组较差（P＜0.05）；两组所观察的有效肾小球数均≥3个，两组数据差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 冰冻切片的免疫荧光染色标本无肾小球的时候，可以采用胰酶抗原修复作为补救措施。
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关键词 抗原修复方法；肾活检；石蜡切片；免疫荧光染色
[中图分类号] R692.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）05（c）－０190-02
[作者简介] 谭文（1976.11-），男，湖南茶陵人，本科，主管病理技师，研究方向：病理技术。
[通讯作者] 贾晓敏（1976.3-），女，河北人，本科，主管病理技师，研究方向：病理技术。
免疫荧光技术又被称为荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种，具有特异性强、敏感性高、速度快等特点，在肾穿刺活检的病理诊断中具有很大的意义。选取该院2013年2月—2013年9月间确诊为肾小球疾病的患者为研究对象，主要探讨了不同的抗原修复方法对肾活检标本石蜡切片免疫荧光染色的影响，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
该院共接收30例经确诊为肾小球疾病的患者，男性14例，女性16例，年龄在19~64周岁之间，平均年龄为（41.5±13.4）周岁。其中有9例患者属于IgA肾病，8例患者属于局灶节段硬化性肾小球肾炎，6例患者属于轻度系膜增生性肾小球肾炎，4例患者属于膜性肾病，3例患者属于系统性红斑狼疮。将每例患者的肾活检标本分别制成采用10%福尔马林固定的2 μm厚石蜡切片，和2 μm厚的冰冻切片，冰冻切片为对照组，石蜡切片为研究组，并将研究组的标本随机分为胰酶抗原修复组、无抗原修复组、高压加热抗原修复组，分析和对比两组的免疫荧光染色结果，两组患者的年龄、性别、病程、病史等一般资料，数据差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 仪器与试剂准备 仪器准备：1个湿盒、1个电高压消毒锅，和3个过酸立式染缸。所有标本均采用型号为Nikon，80i的荧光显微镜进行观察。试剂为：由丹麦DAKO公司生产的异硫氰荧光素标记的免抗人IgA、IgG、IgM、C1g、C3、Fib，和福州迈新生物技术公司生产的胰酶，以及采用自配制的枸橼酸-枸橼酸盐缓冲液，3%过氧化氢溶液、PBS液。
1.2.2 修复方法 先将所有标本进行常规处理。将玻片进行特殊处理后浸泡在多聚赖氨酸中，取出干燥备用。然后进行连续切片2 μm，裱于载玻片上，将其置于60 ℃上进行烤片，5 h后取脱蜡水对标本进行清洗，采用PBS缓冲液反复清洗数次，取3%过氧化氢溶液将标本的过氧化物酶进行去除，处理时间一般为10 min。最后，按照研究组的3种抗原修复方法分别进行免疫荧光染色。
①无抗原修复组。标本进行常规处理后，放置待用。
②胰酶抗原修复组。将常规处理后的标本在37 ℃的恒温箱子里采用0.25%的胰酶进行孵育，当15 min以后再用蒸馏水对标本进行反复冲洗两次，将标本上的胰酶冲洗干净。
③高压加热抗原修复组。将枸橼酸-枸橼酸盐缓冲液倒入过酸立式染缸中，再将立式染缸放进电高压消毒锅中，盖上锅盖，打开压力阀，将过酸立式染缸中的枸橼酸-枸橼酸盐缓冲液煮沸，然后打开锅盖，将常规处理好的标本放入枸橼酸-枸橼酸盐缓冲液中，将电高压消毒锅进行密封，并盖上锅盖和关紧压力阀，再次进行加热，直到电高压消毒锅开始喷气，并喷气两分钟后，将电高压消毒锅的电源关闭，打开压力阀和锅盖，然后将锅内的过酸立式染缸取出，于常温下放置20 min，冷却待用。
研究组所有标本均进行不同的修复方法处理后，用蒸馏水反复冲洗两次，再用PBS缓冲液清洗两次，每次清洗时间为3 min，清洗完成后将标本擦干，与冰冻切片一起放入准备好的湿盒内，取相应的抗体10 μL分别滴入标本上，在保持37 ℃的恒温下进行孵育，1 h后，再次取PBS对标本进行清洗2次，最后取甘油进行封片处理。用荧光显微镜观察染色结果。
1.3 观察指标
观察和比较两组的有效肾小球数和荧光抗体IgG、IgA、IgM、C1q、C3的沉积位置。根据荧光抗体的沉积位置和荧光强度进行评定标本的阳阴性，阴性（-）：采用低倍镜无法看见荧光，采用高倍镜似可见荧光；弱阳性（+）：采用低倍镜似可见荧光，采用高倍镜可见荧光；阳性（++）：采用低倍镜可以明显的看见荧光，采用高倍镜荧光非常清晰；较强阳性（+++）：在低倍镜下荧光非常清晰，在高倍镜下荧光表现为耀眼；强阳性（++++）：在低倍镜下荧光表现为耀眼，在高倍镜下荧光表现为刺眼。
1.4 统计方法
所有数据均采用统计学软件SPSS17.0进行分析和处理，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 两组有效肾小球数比较
两组标本所观察到的有效肾小球数均≥3个，两组数据差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。
2.2 3种抗原修复法与对照组免疫荧光染色比较
研究组中的胰酶抗原修复组与对照组的免疫荧光染色结果基本相同（P＜0.05）；研究组中高压加热抗原修复组的假阴性明显高于对照组（P＜0.05），研究组中无抗原修复组的染色效果比对照组较差（P＜0.05）。见表2。
3 讨论
在肾疾病的诊断过程中，肾活检组织免疫的检查起到诊断标志性的作用，在肾活检组织免疫的检查中，主要分为冰冻切片免疫荧光染色检查和石蜡切片免疫荧光染色检查。但是在传统的验证中，由于福尔马林固定会使标本的蛋白质产生交联的现象，抗原决定簇被封闭，因此，传统认为福尔马林固定的石蜡切片并不适合进行肾活检标本的免疫荧光染色。经文献[2]发现，事实上抗原先将标本进行抗原修复后，再对标本进行石蜡切片的免疫荧光染色处理，可以达到临床诊断的效果。
该研究通过分析了不同抗原修复方法对肾活检标本的免疫荧光染色结果，以及比较了无抗原修复组、高压加热抗原修复组、胰酶抗原修复组，分别与对照组冰冻切片的免疫荧光染色结果，结果显示：研究组中无抗原修复组的染色效果比对照组较差（P＜0.05），研究结果与传统观点相同，研究组中的胰酶抗原修复组与对照组的免疫荧光染色结果基本相同；研究组中高压加热抗原修复组的假阴性明显高于对照组（P＜0.05），研究结果与文献[6]基本相同。该研究分析，由于冰冻切片组在试剂盒的使用过程中会出现未发生或例数较少发生无肾小球的情况，从而要对冰冻切片组进行补救，在补救的时间过长，操作步骤较复杂，因此冰冻切片组的检出的假阴性较低。
综上所述，胰酶抗原修复组的免疫荧光染色结果最好，与冰冻切片的结果基本相符，因此，冰冻切片的免疫荧光染色标本无肾小球的时候，可以采用胰酶抗原修复作为补救措施。
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（收稿日期：2014-02-24）