摘 要：特发性肺纤维化(IPF)是严重危害我国居民健康的呼吸系统疾病之一，发病机制复杂且缺乏理想治疗药物，已成为重大公共卫生问题。IPF发生发展过程中表观遗传修饰得到了广泛的关注，新近越来越多研究证实特定基因甲基化、组蛋白乙酰化和miRNA差异性表达均可能作为IPF的信号分子，在疾病诊断、病情严重程度评估和治疗方面发挥不可预估的作用，以此阐述IPF发病机制具有重要意义。中医药治疗IPF历史悠久，具有整体调节的独特疗效和明显优势，且安全性较高，目前临床上使用中医药治疗IPF已然成为发展趋势。新近研究发现中药复方和单体成分通过表观遗传修饰发挥抗纤维化作用。本文拟对表观遗传修饰在IPF发生发展中的作用机制以及中医药通过调控表观遗传防治IPF作用进行综述，以期为中医药现代化研究更好指导IPF临床实践提供思路。
关键词:特发性肺纤维化;表观遗传修饰;中医药; DNA甲基化;组蛋白修饰;微小RNA;
Research Status of TCM in Prevention and Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis
Based on Epigenetic Modification
JIAO Rui LIU Yongming JIANG Huilai WANG Tianjiao LYU Xiaodong MA Lijia YANG Li
The Afiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine Liaoning University of
Traditional Chinese Medicine
Abstract：Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is one of the respiratory diseases that seriously endanger the health of Chinese residents. Its pathogenesis is complex and clinically ideal therapeutic drugs are still lacking for treatment of IPF. It has become a major public health problem. During the development of IPF, epigenetic modification has received extensive attention. Recently, more and more studies have confirmed that methylation of specific genes, histone acetylation and differential expression of miRNAs may all act as signal molecules of IPF and play an unpredictable role in disease diagnosis, disease severity assessment and treatment. It is of great significance to explain the pathogenesis of IPF. The treatment of IPF with traditional Chinese medicine (TCM) has a long history, with unique efficacy and obvious advantages of overall regulation, and high safety. At present, the clinical use of TCM to treat IPF has become a development trend. Recent studies have found that Chinese herbal compounds and monomer components play an anti fibrosis role through epigenetic modification. This paper reviews the mechanism of epigenetic modification in occurrence and development of IPF and the role of TCM in prevention and treatment of IPF by regulating epigenetic modification, in order to provide ideas for the modernization of TCM to better guide the clinical practice of IPF.
Keyword：idiopathic pulmonary fibrosis; epigenetic modification; traditional Chinese medicine; DNA methylation; histone modification; microRNA;
特发性肺纤维化(IPF)是一种局限于肺部的慢性进行性纤维化性间质性肺炎的特殊类型，发病原因尚未明确，好发于老年男性，组织学和/或影像学表现为普通型间质性肺炎[1]。IPF具有渐进式特征，大多数患者中后期表现为持续性呼吸困难和肺功能恶化，终末期多因呼吸衰竭而发生死亡，预后不良[2]。目前被推荐用于IPF治疗药物吡非尼酮和尼达尼布能够在一定程度上缓解症状、改善肺功能和生命质量，但沉重经济负担、诸多不良反应以及尚未存在证据说明是否有助于提高生存率，导致使用受到限制[3]。中医药治疗IPF历史悠久，具有整体调节的独特疗效和明显优势，且安全性较高，目前临床上使用中医药治疗IPF已然成为发展趋势[4]。近年来，众多研究显示表观遗传学对于IPF的影响受到越来越多的关注。在IPF患者表观基因组中均可发现DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA表达调控显著动态变化，对于IPF发病机制阐述发挥具有极为重要作用[5,6]。本文拟对表观遗传修饰在IPF发生发展中的作用机制以及中医药通过调控表观遗传防治IPF研究现状加以总结，以及为中医药防治IPF作用机制研究提供科学依据。
1.表观遗传修饰在IPF发生发展中的作用机制
1.1 DNA甲基化与IPF
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶催化作用下，将S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体转移到DNA核苷酸的一种化学修饰过程，主要发生于结构基因启动子的核心序列和转录起始点胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤双核苷酸(CpG)岛，表达修饰主要是将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶，此外还可生成N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤[7,8]。近年来越来越多研究显示，CpG岛广泛DNA甲基化改变与IPF发病机制密切相关，可为IPF诊断效能和靶向治疗开创研究方向[9,10]。DNA甲基化在IPF中的研究主要集中于全基因组DNA甲基化和特异基因序列启动子区甲基化两部分内容。
全基因组DNA甲基化研究检测范围均以CpG岛为主,对于阐述IPF表型形成基因表达变化具有重要意义。Huang等[11]通过比较IPF患者与健康受试者成纤维细胞基因组DNA甲基化水平，证实IPF患者基因组中多个CpG位点出现异常甲基化。Sanders等[12]采用甲基化阵列法对IPF患者和健康对照者全基因组DNA甲基化进行分析发现两组间存在870个差异甲基化CpG基序,且35个甲基化CpG基序与基因差异表达相关，证实IPF患者存在一套相对稳定的差异化甲基化谱。Lee等[13]采用甲基化阵列法分析IPF患者成纤维细胞全基因组DNA甲基化水平和差异基因表达关系总计发现80个甲基化CpG序列与34个差异表达基因mRNA表达显著相关，基因本体富集包括细胞黏附、分子结合、化学内环境稳态、受体结合，均为参与IPF发病机制过程。
特异基因序列启动子区甲基化研究对于深入探索IPF发病机制、早期诊断、疾病分期和治疗预后具有重要意义。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)被认为是IPF特异性标志蛋白，是成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的关键指标。Xiang等[14]通过转化生长因子β1(TGF-β1)处理IPF患者肺成纤维细胞，应用染色质免疫沉淀和小干扰RNA(siRNA)敲除检测甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)与α-SMA-CpG富集区调控关系，应用DNA甲基转移酶抑制剂5'-氮胞苷处理肺成纤维细胞观察富含CpG区域DNA甲基化状态对α-SMA表达影响，结果发现α-SMA和MeCP2丰富关联，siRNA敲除MeCP2可减少TGF-β1对α-SMA上调表达，5'-氮胞苷处理α-SMA表达降低同时发现MeCP2结合减少，说明DNA甲基化对α-SMA表达及纤维增生发挥重要调节作用。胸腺细胞分化抗原1(Thy-1)主要表达于正常肺成纤维细胞，具有调节细胞基质交互的重要作用。Thy-1阴性的IPF患者肺成纤维细胞能够更为迅速导致肌纤维母细胞生成和肺部瘢痕形成。Robinson等[15]通过缺氧环境培养IPF患者肺成纤维细胞，应用流式细胞术检测DNA甲基化整体水平变化，应用实时PCR检测Thy-1、α-SMA、I型胶原(Col I)、Col III表达，应用甲基化特异性PCR检测Thy-1启动子甲基化状态，研究显示缺氧肺成纤维细胞更为容易检测全局甲基化水平，并且伴有肌成纤维细胞标记物表达增加，Thy-1 mRNA在缺氧环境中表达受到抑制，甲基化特异性PCR显示Thy-1在肺成纤维细胞暴露于1%氧气后甲基化状态显著，说明DNA甲基化对IPF肺成纤维细胞中Thy-1表达发挥重要调控作用。
1.2 组蛋白修饰与IPF
组蛋白修饰是指染色质的组蛋白在相关酶催化下N端氨基酸残基发生特异位点的翻译后共价修饰过程，修饰方式包括磷酸化、甲基化、ADP核糖基化、乙酰化、泛素化，其中乙酰化修饰最为常见[16]。组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)通过调节组蛋白或者转录因子乙酰化状态以此来调控基因沉默和活化状态，其中HDAC与促炎基因转录调控密切相关，因此HDAC抑制剂常被用于IPF发病机制和药物研发研究[17]。Saito等[18]以IPF成纤维细胞-肌成纤维细胞分化为重点，发现HDAC8在IPF肺组织和TGFβ1处理正常人肺成纤维细胞中表达显著增加，HDAC8选择性抑制剂NCC170、siRNA敲除HDAC8均能够有效抑制α-SMA蛋白表达、增加过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达，使用染色质免疫沉淀定量PCR显示NCC170能够抑制PPARγ基因增强子乙酰化组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27ac)丢失。李珊等[19]通过采集IPF患者和无呼吸道疾病体检者外周血，研究发现IPF患者外周血单个核细胞的胞质蛋白、核蛋白HDAC活性显著升高。Zhang等[20]研究发现HDAC1能够通过抑制上皮钙黏素、紧密连接蛋白-1启动子活性调节TGF-β1诱导的上皮间质转化(EMT),PI3K/HDAC抑制剂CUDC-907能够有效调节下游系列细胞功能、减轻博来霉素致小鼠肺纤维化现象。在IPF甲基化修饰交互调节机制中最为常见的是H3K27三甲基化(H3K27me3)、H3K9me2、H3K9me3。Coward等[21]研究证实，IPF患者肺成纤维细胞中CXCL10启动子处组蛋白甲基转移酶EZH2介导组蛋白H3K27me3与G9a介导H3K9me3甲基化均显示显著富集，EZH2基因敲除发现H3K27me3、H3K9me3均显著降低，G9a基因敲除同时发现H3K9me3、H3K27me3亦可显著降低，EZH2和G9a缺失则可逆转组蛋白去乙酰化修饰、恢复IPF患者肺成纤维细胞中CXCL10表达。
1.3 miRNA表达调控与IPF
miRNA是一类广泛存在于生物体内的非编码单链小分子RNA，能够与靶基因mRNA特定区域结合以介导mRNA降解和诱导染色质结构改变进而调控基因表达。近年来许多研究揭示IPF患者存在miRNA调节异常[22,23]。miRNA表达调控在IPF中的研究主要集中于肺上皮细胞修复、EMT、成纤维细胞活化、胶原蛋白生成、肌成纤维细胞分化、巨噬细胞极化、TGF-β信号通路、细胞衰老等多方面内容。
miR-30a在IPF小鼠体内表达明显下调,TET1是miR-30a的靶基因，研究发现miR-30a能够靶向与TET1结合并降低其表达，阻断线粒体分裂，进而抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡以发挥抗纤维化作用[24]。
miR-153在IPF患者血清和人肺成纤维细胞中显著低表达，SNAI1是miR-153的靶基因，并且能够靶向抑制SNAI1 mRNA表达，同时降低α-SMA、Col I、波形蛋白、纤连蛋白表达，进而抑制EMT过程以发挥抗纤维化作用[25,26]。
miR-221在IPF患者肺组织和肺细胞中表达显著减少，HMGA2是miR-221的靶基因，HMGA2是EMT关键调节因子，研究证实转染miR326模拟物能够有效抑制TGF-β1诱导腺癌细胞和支气管上皮细胞波形蛋白、N-钙粘蛋白(N-cad)、α-SMA、Col I、Col III表达水平以及增强E-cad表达水平，还能够直接靶向HMGA2表达和介导TGF-β1/Smad3信号通路，进而抑制EMT过程以发挥抗纤维化作用[27]。
miR-27b在IPF小鼠和肺成纤维细胞中表达下调，TGF-β受体1和SMAD2是miR-27b的靶基因，研究显示miR-27b通过靶向TGF-β受体1和SMAD2抑制成纤维细胞活化，进而降低TGF-β1刺激胶原 mRNA、α-SMA蛋白表达以发挥抗纤维化作用，miR-27b可作为IPF患者潜在的诊断标志物和治疗靶点[28]。
miR-155在野生型IPF小鼠和miR-155-/-小鼠中低表达，研究证实miR-155基因敲除能够增加miR-155-/-小鼠Col I、Col III mRNA表达和胶原沉积，导致肺成纤维细胞和巨噬细胞LXRα去调节以发挥促纤维化表型作用，miR-155/LXR通路调控对IPF诊断和治疗具有巨大潜力[29]。
miR-27a-3p在TGFβ1诱导IPF患者肺成纤维细胞中表达显著减少，并且其水平与Smad2/3依赖性方式密切相关，研究发现miR-27a-3p敲除能够增强肌成纤维细胞分化，直接靶向肌成纤维细胞表型标记物α-SMA、Smad2/4发挥作用，慢病毒载体治疗性表达miR-27a-3p则可减少博莱霉素诱导IPF小鼠肺纤维化，miR-27a-3p是治疗纤维化器官疾病一种新的治疗方法[30]。
miR-328在IPF大鼠中显著高表达，FAM13A是miR-328的靶基因，研究证实M2型巨噬细胞源性外泌体与肺成纤维细胞共培养释放miR-328能够靶向降低FAM13A蛋白表达水平，进而增强肺成纤维细胞增殖活力以及Col I、Col III、α-SMA表达以促进IPF疾病进展[31]。
miR-326在IPF患者肺组织和多个细胞系中表达下调，其水平与TGF-β1表达呈现负反馈相关，研究显示miR-326能够直接下调促纤维化基因Ets1、Smad3、MMP9以及上调抗纤维化基因Smad7表达，转染miR326模拟物能够有效抑制博来霉素诱导IPF小鼠TGF-β1表达以发挥抗纤维化作用[32]。
miR-34a在IPF患者和小鼠肺泡上皮细胞中表达上调，miR-34a缺陷小鼠肺成纤维细胞衰老表型降低、抗凋亡能力增强，通过增强肺成纤维细胞β-半乳糖苷酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4、p21等细胞衰老标记物活性以及降低细胞增殖能力、透明质酸合成酶2活性，进而诱导衰老表型发挥促进纤维化作用[33]。
miRNA特异性表达可加速或阻遏IPF疾病进程。目前许多miRNA的具体作用靶点和调控机制尚不清楚，但随着相关研究持续深入开展，miRNA会为IPF的临床诊断和治疗提供新的理论依据和研究方向。
2.中医药调控表观遗传修饰对IPF作用机制
新近越来越多研究表明，中医药通过作用于DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA表达调控，在IPF发生、发展中发挥重要作用。
目前研究发现，IPF患者基因组甲基化和表达水平存在显著负相关，研究热点多集中于全基因组甲基化水平和甲基化过程关键酶作用。陈惠等[34]探究养肺活血方抗IPF作用机制，采用全基因组甲基化测序方法对养肺活血方干预IPF大鼠肺组织进行功能分析，结果发现各组别间存在差异甲基化区域，养肺活血方具有调控DNA甲基化作用，能够降低HIF-1、TGF-β1、IGFBP2、NOTCH1、UHRF1 mRNA表达，进而抑制Notch信号通路活化和调控成纤维细胞-肌成纤维细胞表型转化发挥干预作用。肖娜等[35]探析陈皮碱性提取物抗肺纤维化活性成分，结果显示陈皮碱性提取物分离化合物均对人胚肺成纤维细胞具有明显抑制作用，黄酮类化合物可被肠壁上皮细胞甲基化转移酶进行酚羟基甲基化后显示出药物活性。
近年来研究广泛认为，HDACs抑制剂通过促进纤维细胞凋亡、抑制成纤维细胞增殖、降低细胞外基质合成、调控细胞自噬等途径发挥IPF预防保护作用，研究热点多集中于组蛋白乙酰化修饰以及HAT、HDAC、泛素连接酶作用。Lee等[36]研究证实，中药成分蓝雪醌通过抑制HAT蛋白p300活性进而降低TGF-β诱导肺成纤维细胞的纤维化靶基因表达以及博来霉素诱导IPF小鼠的肺纤维化和炎症细胞水平，进而抑制细胞外基质(ECM)沉积发挥抗纤维化作用。Smad泛素化调节因子(Smurf)作为TGF-β/Smad信号通路传导蛋白泛素连接酶E3的关键因子，可选择性将泛素分子与底物相结合进而介导关键组分降解。彭艳芳等[37,38]研究表明，芪归方有效组分黄芪甲苷和阿魏酸通过减少博来霉素诱导IPF大鼠和TGF-β1诱导人胚肺成纤维细胞中Smurf2介导Smad7、SnoN泛素化，调控TGF-β/Smads信号通路，从而抑制ECM沉积以调节IPF的发生发展。覃惠等[39]研究发现，宣肺化瘀方能够有效上调IPF大鼠肺组织Ub、PSMC2、Smurf1、Smurf2蛋白表达，激活泛素-蛋白酶体通路，进而降低TGF-β1蛋白含量、减缓胶原纤维形成发挥抗纤维化作用。
关于miRNA表达调控在中医药防治IPF研究热点主要集中于机制探讨方面，众多研究表明中医药能够有效调控miRNA表达发挥干预作用。博来霉素诱导IPF大鼠和TGF-β1刺激人肺成纤维细胞能够显著上调miRN-21和下调let-7d表达，诸多中药单体（槲皮素、白藜芦醇、黄芩总黄酮、丹皮酚、大黄酸、沙苑子总黄酮、黄芩素、黄芪总黄酮）均能够抑制miR-21和增强let-7d表达，减轻Col I、Col III、α-SMA等胶原蛋白标志物表达，进而调控TGF-β1/Smad信号通路和NF-κB信号通路、提高抗氧化活性、抑制炎症反应和ECM沉积从而发挥治疗作用[40,41,42,43,44,45,46,47,48]。蒋小岗等[49]研究表明，黄芩素通过抑制miR-21表达水平，还可下调上游转录因子STAT3活化以及上调下游靶点Spry1蛋白表达，进而抑制肺成纤维细胞转化。徐昌君等[50]等研究显示，黄芪甲苷、槲皮素、黄芪总黄酮通过抑制miR-21表达，下调p62、p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K以及上调LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表达，进而调控AKT/mTOR/P70S6K信号通路激活细胞自噬以阻止EMT过程。彭艳芳等[51,52]研究证实，芪归方通过下调miR-21活性和上调miR-29b、miR-326活性，既可抑制NF-κB、TGF-β1、结缔组织生长因子含量，又可抑制p-Smad2、p-Smad3和增强Smad7表达，从而调控TGF-β1/Smad信号通路、减少ECM沉积、抑制炎症反应发挥治疗作用。李雅群等[53]探究桑白皮提取物桦木酸对TGF-β1诱导人肺泡上皮细胞EMT抑制作用，结果显示桦木酸通过抑制miR-200b-5p、miR-200c-5p表达，下调Col I、α-SMA表达和上调E-cad表达，进而阻止EMT过程。王聪捷等[54]研究表明，紫杉醇通过上调TGF-β1诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞miR-140表达，降低TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA、Col I、波形蛋白表达以及增强E-cad表达，进而调控TGF-β1/Smad3信号通路、阻止EMT过程。童佳欢等[55]研究显示，黄芪甲苷通过升高miR-29b水平，下调TGF-β1、Smad3、p-Smad3、活性氧、丙二醛表达和上调超氧化物歧化酶表达，进而调控TGF-β1/Smad3信号通路和氧化应激反应。史立言等[56]应用Transwell共培养建立IPF小鼠成纤维细胞对巨噬细胞趋化模型，结果证实鹿茸干细胞外泌体通过抑制let-7b、let-7a表达，下调CCL-7表达水平，进而调控巨噬细胞迁移。田丽等[57]研究证实，加味补阳还五汤通过抑制IPF大鼠和TGF-β1诱导人胚肺成纤维细胞miR-126表达，下调血管内皮生长因子、缺氧诱导因子1α、Col I、Col III表达水平，进而调控血管新生发挥抗纤维化作用。
表1 中医药调控表观遗传修饰与IPF相关效应机制
3.总结与展望
综上所述，IPF发生发展过程中表观遗传修饰得到了广泛的关注，新近越来越多研究证实特定基因甲基化、组蛋白乙酰化和miRNA差异性表达均可能作为IPF的信号分子，在疾病诊断、病情严重程度评估和治疗方面发挥不可预估的作用。而中医药通过表观遗传修饰治疗IPF是一个全新的研究方向，对于抑制病情发展和改善预后具有独特优势。但是，IPF发病是多种效应细胞因子共同构成的一个复杂网络，多种机制参与其中，彼此之间相互影响、相互作用，共同促进肺纤维化发展。中医药对于IPF表观遗传修饰研究尚待改进：其一，IPF表观遗传修饰如何启动并与其他调节机制协调发挥作用目前尚未完全阐明；其二，现有研究主要是针对单一靶标进行，忽略了中医药多途径、多靶标、多机制作用特点[58,59]。随着表观遗传修饰研究的不断深入，中医药治疗IPF研究将更加科学化和个性化，为中医药现代化研究更好指导临床实践提供思路。
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