孙玉凤 罗亚非* 范瑞娟
贵阳中医学院基础医学院，贵州贵阳550002
基金项目：贵州省科技厅联合基金项目（黔科合中药字［2011］LKZ7034号）。
作者简介：孙玉凤（1986-），女，贵阳中医学院2012级中西医结合基础理论专业研究生。
通信作者：罗亚非（1965-），男，教授，主要从事中药对脑血管疾病形态学影响的研究。E-mail：944943527@qq.com
【摘要】目的：探讨桃红四物汤对雄性SD大鼠脑缺血再灌注损伤海马CA1区神经元的作用。方法：采用改良后的新式线栓法建模，随机分为大脑中动脉阻塞再灌注组、正常组、桃红四物汤低、中、高剂量治疗组，每组各20只。治疗组连续7d灌胃治疗，每日两次，早、晚各一次；模型组和正常组正常喂养。自第8天，对各实验组大鼠进行神经功能评分并处死取脑，用Nissl染色法观察海马CA1区神经元的形态和数量。结果：与模型组比较，桃红四物汤治疗组的神经功能评分明显增加(P＜0.01)；Nissl染色治疗组显示海马CA1区神经元数量明显增加，随给药剂量增加而增加(P＜0.01)。结论：脑缺血再灌注后，给予桃红四物汤能显著改善损伤大鼠的大脑神经功能，增加海马CA1区神经元数量，并且其治疗效果随桃红四物汤给药剂量的增加而增强。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 脑缺血再灌注；桃红四物汤；SD大鼠；海马CA1区
【中图分类号】R285.5【文献标志码】A【文章编号】1007-8517(2015)03-0009-03
脑缺血再灌注一方面可挽救濒临死亡的细胞，另一方面又加重细胞损伤，导致细胞死亡。如何通过药物降低脑缺血再灌注损伤，减少缺血细胞的死亡已经成为当前研究的热点。桃红四物汤又名加味四物汤，出自于《医垒元戎》，该方由四物汤加桃仁及红花组成。方以熟地黄为君药，既可以滋养阴血，又可以补肾填进；当归作为臣药，养血又活血；白芍益阴养血；川芎活血行气；桃仁、红花活血祛瘀。全方以活血为主，兼养血，共奏养血活血之功效。现代研究显示桃红四物汤有改善微循环［1］、抗血栓［2］、抗炎及提高免疫力［3］、抑制细胞凋亡［4］等作用。该方治疗缺血性脑血管疾病所引起的脑缺血再灌注损伤的作用机制尚不十分清楚。本实验通过神经功能评分及Nissl染色，研究桃红四物汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后海马CA1区神经元的治疗作用。
1实验材料
1.1实验动物雄性SD大鼠，体重250g～300g（由长沙市天勤生物技术有限公司提供）。
1.2材料桃仁5g，红花2.5g，熟地黄5g，白芍5g，当归5g，川芎2.5g，均购自北京同仁堂贵阳分店。先加蒸馏水煮沸，合并2次药液，按原方比例浓缩成生药浓度分别为低（0.7g/kg）、中（1.4g/kg）、高（2.1g/kg）三种不同剂量［5］的桃红四物汤水煎液，4℃冰箱保存备用。
1.3试剂及试剂盒4％水合氯醛：40g水合氯醛粉末，29g磷酸氢二钠，2.965g磷酸二氢钠，1000ml蒸馏水（于60℃水浴锅中加热充分溶解冷却后，4℃保存）；Nissl染色液，焦油坚牢紫1g，蒸馏水100ml；0.1％TritonX-100通透液配制方法：0.1g柠檬酸钠，100ml蒸馏水；0.1TritonX-100（pH7.0），蒸馏水加至1000ml，37℃水浴中3h，充分溶解混匀；其他如中性树胶、酒精、二甲苯等均为市售国产分析纯。
1.4仪器手术显微镜（日本Sanyo公司）；大鼠脑切片模具（上海玉研科学仪器有限公司）；BS-110S电子天平（北京德赛公司）；KH-BM型石蜡自动包埋机（浙江科迪有限公司）；病理切片机（德国LEICA公司）；MLTRAGEMK2型超纯水系统（英国ELGA公司）；电热恒温干燥箱（上海博迅公司）；光学显微镜（日本Sanyo公司）。
2方法与结果
2.1实验方法
2.1.1实验动物分组及给药方法将100只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组（大脑中动脉阻塞再灌注组）、桃红四物汤低（0.7g/kg）、中（1.4g/kg）、高（2.1g/kg）剂量组共5组，每组各20只。桃红四物汤低、中、高剂量组分别以桃红四物汤低、中、高剂量灌胃，每日早晚各一次。模型组不进行任何治疗，正常组正常饲养。至第8天时，将各组大鼠处死并取脑，取下的脑组织用于制作病理切片。
2.1.2大鼠线栓法局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO）制作实验前对大鼠适应性喂养一周，自由饮水进食。术前12h禁食，自由饮水。3％水合氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，取仰卧位，将大鼠四肢固定，颈前区备皮，常规消毒。颈正中线切口3～4cm，钝性分离两侧甲状腺，暴露右侧的胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌之间的三角区域；沿胸锁乳突肌内侧分离肌肉筋膜，暴露颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）；在CCA的近心端和远心端分别穿线备用，两线相隔约1～2cm左右；近心端系紧，约距此节1cm处的远心端为松节备用；在CCA近分叉处以微动脉夹暂时夹闭；在CCA的两线间，距CCA分叉处5mm左右，剪一斜行45°小口；待直径约0.23mm的栓线插入CCA后，取下微动脉夹；将栓线沿CCA插入ICA，最后送入大脑中动脉（MCA），在标记接近CCA分叉处或着遇阻力感时停止（插入距离一般为(18.5±0.5)mm的深度），在缺血90min后缓慢抽出栓线，将CCA上远心端的松结系紧，并缝合。
2.1.3神经功能评分参照GarciaJH神经功能评分标准［6］，于术后24h、第8天对实验大鼠评分并记录，以评价大鼠的神经行为学。包括以下6项：自主运动、四肢运动的对称性、前爪的伸展性、攀爬运动、肢体的本体感觉、触须反应。
2.1.4Nissl染色对制作好的石蜡切片，二甲苯脱蜡10min，放入100％乙醇洗5min，90％乙醇5min，70％乙醇5min，蒸馏水2min。处理好的样品放入尼氏染色液中染色10min，蒸馏水洗2次，90％乙醇洗5s，70％乙醇洗5s，经95％乙醇脱水2min后，再换新鲜95％乙醇脱水2min，二甲苯透明5min，换用新二甲苯再透明5min，最后，以中性树胶封片。
2.1.5图像分析使用光学显微镜在400倍镜下随机选取5个视野，记录5个视野中正常神经元的总和，观测各组大鼠海马CA1区神经元形态和数量。Nissl染色以细胞浆和细胞核呈深蓝色，细胞形态完整者为正常神经细胞。
2.1.6统计学处理采用SPSS20.0进行数据处理，连续变量用（x±s）表示，检验方法为单因素方差分析，所有分析都采用双侧检验法，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.2实验结果
2.2.1一般情况正常组大鼠的精神状态良好，活动灵活，毛发白而有光泽，皮肤粘膜红润，饮食量、饮水量均正常，体重呈稳步上升趋势。模型组与桃红四物汤各剂量组大鼠术后与术前相比均出现神差、毛发暗淡无光泽、饮食饮水减少、体重减轻、活动障碍等现象。活动障碍主要表现为同侧的Horner征阳性、眼裂变小、眼球内陷、瞳孔缩小，且伴有非手术侧肌张力的下降、躯体向非手术侧倾斜屈曲甚至扭转、尾部弯向非手术侧、提尾悬空时呈强迫性体态。在术后的7d时间里，模型组的整体状态变化并不明显，而桃红四物汤各剂量组大鼠一般情况及活动障碍表现与模型组相比均有所改善。其中低剂量组大鼠精神状态及饮食饮水等一般情况均有所恢复，活动障碍略微减轻；中剂量组饮食、饮水恢复良好，体重有所上升，活动障碍一定程度减轻；高剂量组大鼠饮食饮水恢复正常，体重回升，活动障碍明显减轻。可见随给药剂量的增加，大鼠一般情况的改善情况也愈加明显。
2.2.2神经功能评分各组大鼠在处死前均进行神经功能评分，正常组未出现神经功能缺损表现，神经功能评分为18分。模型组大鼠出现明显的神经功能缺损表现，神经功能评分较正常组明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，桃红四物汤低、中、高剂量组均能显著改善大鼠神经功能缺损的症状，增加大鼠的神经功能评分（P＜0.01）。经桃红四物汤治疗后，高剂量组大鼠的神经功能评分明显高于中剂量组及低剂量组（P＜0.01）；中剂量组大鼠的神经功能评分高于低剂量组（P=0.002＜0.01）。见表1。
2.2.3Nissl染色统计分析显示，模型组大鼠海马CA1区神经元缺血再灌注区域正常存活神经元的个数较正常组显著减少（P＜0.01）；桃红四物汤低、中、高剂量组大鼠海马CA1区神经元缺血再灌注区正常存活神经元个数较模型组均明显增多（P＜0.01）；桃红四物汤各剂量组中，高剂量组大鼠海马CA1区神经元缺血再灌注区域正常存活神经元多于中剂量组（P=0.011<0.05）及低剂量组（P＜0.01），中剂量组大鼠海马CA1区神经元缺血再灌注区正常存活神经元又多于低剂量组（P＜0.01）。见表2、图1。
3讨论
研究表明，脑缺血损伤引起的神经细胞死亡中，凋亡是重要的神经细胞死亡方式［7］，且多发生在缺血再灌注24h之后，是迟发性神经元死亡(delayedneurondeath，DND)的主要参数与形式。据文献报道［8］，海马CA1区神经元对脑缺血缺氧最为敏感，脑缺血诱导的神经细胞凋亡在缺血后72h达到高峰，并且持续存在可长达数周［9］。桃红四物汤各剂量组均能改善脑缺血再灌注模型大鼠的神经功能缺损症状，降低其脑梗死体积率，减轻其大脑皮质缺血区域的病理损伤。随给药剂量的增加，桃红四物汤对脑缺血再灌注大鼠损伤的海马CA1区神经元的治疗作用也得到了加强。
近年来，中药在救治脑血管病的机制研究中取得很大突破，许多研究证实，中药对改善脑缺血性细胞损伤有独特优势［10］。本实验结果表明，桃红四物汤在防治脑缺血再灌注损伤方面，从低剂量开始起效，并且治疗作用随剂量的加大而呈增加的趋势，通过减少大鼠海马CA1区神经元细胞的死亡，对大脑海马CA1区神经元起到治疗作用。但这些实验结果只是初步的探索，对脑缺血再灌注损伤治疗作用的具体机制仍需进一步研究探讨。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献
［1］徐立，时乐，李祥，等．加减桃红四物汤醇提物对寒凝血瘀模型小鼠微循环和凝血时间的影响［J］．江苏中医药，2008，40(11)：121-122．
［2］韩岚，彭代银，许钒，等．桃红四物汤抗血栓形成作用研究［J］．安徽中医学院学报，2010，29(1)：47-49．
［3］蓝肇熙，李红果，张进陶，等．桃红四物汤对大鼠损伤血淤证的影响［J］．华西药学杂志，2008，23(3)：286-287．
［4］连红琴，秦铮然，张月虹，等．桃红四物汤对实验性大肠癌Bcl-2/Bax蛋白及Casepase-3mRNA表达的影响［J］．中华中医药学刊，2011，29(10)：2240-2242．
［5］李鹏，李祥，陈建伟，等．桃红四物汤干预痛经模型小鼠有效部位的谱效关系研究［J］．中国实验方剂学杂志，2010，16(9)：144-149．
［6］徐立，时乐，李祥，等．加减桃红四物汤醇提物对寒凝血瘀模型小鼠微循环和凝血时间的影响［J］．江苏中医药，2008，40(11)：121-122．
［7］KirinoT．Delayedneuronaldeathinthegerbilhippocampusfollowingischemia［J］．BrainRes，1982，239(1)：57-69．
［8］KiharaS，ShiraishiT，NakagawaS，etal．VisualizationofDNAdoublestrandbreaksinthegebilhipocampusCA1followingtransientischemia［J］．NeurosciLet，1994，175(1-2)：133-136．
［9］KirinoT，TamuraA，SanoK．Delayedneuronaldeathintherathippocampusfollowingtransientforebrainischemia［J］．ActaNeuropathol，1984，64(2)：139-147．
［10］陈孝东，曹勇军，王引明，等．参芎注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］．国际脑血管病杂志，2006，14(4)：270-274．
(收稿日期：2014.10.31)