李香1于琳2彭小冰2*梁光义2
1.贵州省黔南民族医学高等专科学校，贵州都匀558000；2.贵阳中医学院，贵州贵阳550000
【摘要】目的：建立RP-HPLC同时测定栀子柏皮汤传统汤剂、经方颗粒剂及单味配方颗粒剂中甘草苷、甘草酸铵含量的分析方法。方法：采用Agilent Extend-C18色谱柱（250mm× 4.6mm，5μm），以乙腈-0.05%磷酸水溶液-甲醇为流动相梯度洗脱，流速为0.8ml/min，检测波长为237nm，柱温30℃。结果：甘草苷及甘草酸铵进样量分别在0.10～0.80μg和0.10～0.50μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率（n=9）分别为100.36%（RSD=0.76%）、100.43%（RSD=1.10%）。结论：本法适用于不同剂型栀子柏皮汤中甘草苷、甘草酸铵的同时测定。
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关键词 栀子柏皮汤；不同剂型；反相高效液相色谱法；甘草苷；甘草酸铵
【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2015)05-0024-02
栀子柏皮汤始载于汉代名医张仲景的《伤寒论》，由栀子、黄柏和炙甘草三味药材组成，用于治疗湿热发黄、热重于湿之阳黄症［1］。甘草的主要有效成分甘草酸、甘草次酸、甘草苷、甘草酸铵，均具有保肝作用［2］ 。为了更好的控制该方的质量，保证临床用药安全，实验以甘草苷、甘草酸铵为考察指标，参考相关文献资料［3-8］，同时测定栀子柏皮汤传统汤剂、经方颗粒剂、单味配方颗粒剂中甘草苷、甘草酸铵含量。结果表明，供试品在反相高效液相色谱中分离效果较好，阴性样品溶液对测定无干扰，方法简单、准确、重复性好，可用于不同剂型栀子柏皮汤中甘草苷、甘草酸铵的同时测定。
1仪器与材料
1.1仪器安捷伦1100高效液相色谱仪（Agilent ChemStation色谱工作站）；WS205电子天平（十万分之一，瑞士梅特公司）；HS10260D超声波清洗机（天津市恒奥科技有限公司）。
1.2材料甘草苷对照品（批号：111610-200604）、甘草酸铵对照品（批号：110731-200408）均购自中国药品生物制品检定所；乙腈、甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。
药材均购自贵州圣济堂制药有限公司，经贵阳中医学院贺祝英主任药师鉴定，栀子是茜草科植物山栀Gardenia jasminoides Ellis.的果实；黄柏为芸香科植物黄皮Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，习称“川黄柏”；甘草为豆科植物甘草Glycxycrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎，均符合2010版《中国药典》的规定。
2方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性实验采用Agilent Extend-C18色谱柱（250mm× 4.6mm，5μm），以乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）-甲醇（C）为流动相梯度洗脱（表1），检测波长为237nm，流速为0.8ml/min，柱温30℃，进样量为10μl，理论板数不低于3000。在此色谱条件下，甘草苷、甘草酸铵与其他组分的分离效果较好。
2.2溶液制备
2.2.1对照品溶液的制备分别精密称取甘草苷、甘草酸铵对照品1.3mg和1.0mg，加70%甲醇溶解，分别定容至25ml和50ml，制成52μg/ml的甘草苷对照品溶液、20μg/ml的甘草酸铵盐对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备
2.2.2.1传统汤剂供试品溶液的制备处方：栀子10g，黄柏6g，甘草3g。按处方比例称取各味药材粗粉（10倍处方量）。加水6000ml煮至约2400ml，过滤，浓缩，定容至1000ml备用（传统方法）。精密吸取汤剂20ml于水浴上蒸干，残渣加入70%甲醇定容至25ml，超声30 min，过滤，滤液备用。
2.2.2.2复方颗粒供试品溶液的制备按传统汤剂制备方法制备得汤剂，进一步浓缩，常压80℃烘干，粉碎，得干浸膏粉备用。精密称取经方干浸膏粉约0.7251g，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇定容至25ml，超声处理30 min，过滤，滤液备用。
2.2.2.3配方颗粒供试品溶液的制备称取各味药材（粗粉）适量，各加8倍量水浸泡20min，煎煮60min，过滤，滤液另器收集，药渣再加6倍量水煎煮60min，过滤，合并两次煎液，制备成各药材的煎液，常压80℃烘干，粉碎，得各单味药干浸膏粉。按处方比例称取适量干浸膏粉配研混合，得单味配方干浸膏粉备用。精密称取单味配方干浸膏粉约1.1472g置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇定容至25ml，超声处理30min，过滤，滤液备用。
2.2.3阴性供试品溶液的制备
2.2.3.1空白溶液的制备取70%甲醇溶液25ml，超声处理30 min，过滤，滤液备用。
2.2.3.2缺甘草溶液的制备按“2.2.2.1”项下方法制备不含甘草的空白对照溶液，备用。
2.3方法学考察
2.3.1专属性考察精密吸取对照品溶液、供试品溶液和空白溶液各10μl，按“2.1”项下条件进样测定。结果见图1，阴性对照样品色谱图中在甘草苷、甘草酸铵相应保留时间位置未见吸收峰，表明其他成分对甘草苷、甘草酸铵含量测定无干扰。
2.3.2线性关系考察分别精密称取甘草苷对照品，甘草酸铵对照品各2.0mg，定容至10ml，作对照品储备液。取甘草苷对照品储备液，分别稀释成浓度为10、20、40、60、80μg/ml；取甘草酸铵对照品储备液，分别稀释成浓度为10、20、30、40、50μg/ml，按“2.1”项下条件进样测定、以甘草苷，甘草酸铵对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），计算甘草苷、甘草酸铵的回归方程分别为：Y=19.787X-16.037（r=0.9995）；Y=6.02X-4.4（r=0.9997）。结果表明甘草苷进样量在0.10～0.80μg与峰面积呈良好的线性关系，甘草酸铵进样量在0.10～0.50μg与峰面积呈良好的线性关系。
2.3.3精密度试验精密吸取“2.2.1”项下甘草苷、甘草酸铵对照品溶液，按“2.1”项下条件进样测定。重复进样测定6次，测得甘草苷峰面积值的RSD为0.75%，甘草酸铵峰面积值的RSD为0.74%，数据表明精密度良好。
2.3.4稳定性实验依据“2.2.2.1”项下制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h时进样，按“2.1”项下条件进样测定，测定其峰面积。甘草苷RSD为1.51%，甘草酸铵RSD为0.68%。说明供试品溶液在24h内稳定。
2.3.5重复性试验依据“2.2.2.1”项下制备供试品溶液，分别制备6份，按“2.1”项下条件进样测定。甘草苷RSD为1.96%，甘草酸铵RSD为2.09%，结果表明重复性良好。
2.3.6加样回收率试验分别精密称取甘草苷及甘草酸铵对照品3.2mg、1.7mg，加70%甲醇定容至5ml。按照“2.2.1”项下的制备方法减半取样平行制备样品9份，分别置锥形瓶中，按高、中、低浓度精密加入甘草苷对照液0.84、1.01、1.26ml，甘草酸铵对照液0.74、0.88、1.1ml，分别按“2.2.2.1”项下方法制备得供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，分别测得样品中甘草苷及甘草酸铵的含量，计算加样回收率。结果甘草苷、甘草酸铵的平均回收率（n=9）分别为100.36%（RSD=0.76%）、100.43%（RSD=1.10%）。
2.4样品含量测定按“2.2.2”项下方法制备传统汤剂供试液、复方颗粒供试液及单味配方颗粒供试液，各3份，分别按“2.1”项下条件进样测定，样品溶液中甘草苷及甘草酸铵的含量结果见表2。
3结果与讨论
探讨采用反相高效液相色谱法同时测定栀子柏皮汤中传统汤剂、复方颗粒、配方颗粒中甘草苷、甘草酸铵的含量，从而摸索这2个指标成分含量测定方法。进一步对栀子柏皮汤配方颗粒、汤剂和复方颗粒中甘草苷及甘草酸铵的含量进行比较，结果显示甘草苷含量（配方＞汤剂＞复方），甘草酸铵含量（配方＞复方＞汤剂），甘草苷和甘草酸铵在配方颗粒中含量均比其他剂型高，可能是因为两种成分在复方中煎煮时发生反应，减少含量。
实验考查了多种色谱条件，分别有乙腈-0.05%磷酸、甲醇-0.05%磷酸，并分别用不同洗脱程序分离；同时对流速、柱温等方面也进行考察选择最优条件。但是上述多种条件在分离甘草苷的时候都具有拖尾现象，且分离不好，而在流速为0.8ml/min，柱温为30℃，乙腈-甲醇-0.05%磷酸梯度洗脱色谱条件最好。
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参考文献
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(收稿日期：2014.12.14)