摘要：酶制剂作为药物已成为生物制药领域的一个热点。世界各国药典中含有越来越多的酶制剂，其中大部分已成为治疗各种重大疾病的有效药物。酶对底物具有很高的亲和力和特异性，而且能催化多种目标分子转化为所需产物，这两种特性使得酶可作为一种特殊药物执行小分子无法进行的治疗性生物化学反应。利用生物技术开发新的酶类药物，采用化学修饰的手段降低治疗酶的免疫原性及提高其相对稳定性，是目前探索酶类药物的研究方向。本文系统地概述了国内外酶作为治疗性药物的最新研究进展及展望。
关键词：酶类药物，生物制药，治疗应用，研究进展
目前，酶作为药物的应用越来越广泛。供治疗用的酶通常指一组用于治疗疾病和改善医疗状况的生物催化剂。酶作为药物有两个突出的特点：(1)酶与底物具有高度亲和性和特异性；(2)酶可以把底物转化成所需的产物，且副作用较小。这两个特点使得酶区别于其他所有类型的药物，也使酶成为有价值的治疗工具，为治疗多种严重疾病提供了一个广阔的现代生物药物应用平台。
治疗用酶有利的动力学性质是低Km和高Vmax，这使其在非常低的浓度和底物浓度下即能达到最大效率。治疗用酶已在医学领域中得到了广泛的应用，药物研发及生物技术在过去20年的进步，极大地促进了治疗用酶在治疗一系列罕见和常见疾病上的应用。利用合成生物学、蛋白质组学和基因组学对酶进行改造，不仅能使其催化出我们想要的手性药物分子，还能极大地促进治疗用酶的开发[1-3]。目前，治疗用酶被广泛应用于遗传性疾病、心血管疾病、胃肠道疾病、癌症等疾病的治疗[4-7]。酶制剂药物被认为是一个不断增长的市场，到2020年预计将超过55亿美元。
图1介绍了治疗用酶的相关应用。
1治疗用酶的来源
治疗用酶广泛来源于动物、植物和微生物。早期研究中的酶是从动物和植物中提取而来。酶的来源决定了酶的方便性、成本和回收过程。由于受到经济可承受性和规模化制备可行性的影响，一般更倾向于对微生物来源的酶进行商业化开发。通过重组DNA(rDNA)技术，在遗传水平上对微生物进行操作可以获得更好的菌株，从而改善酶的质量或特性，并获得更高的产量[8-9]。在基因重组技术中，克隆所需蛋白质的cDNA，然后将克隆的cDNA插入到表达载体中，利用表达载体转化大肠杆菌，使其过表达，最后纯化表达的蛋白。其中，产量、质量、生产时间和提取方便是构建合适的重组酶表达载体的关键参数。目前，多种表达体系已经被建立，包括细菌、真菌、哺乳动物、植物或昆虫细胞等[10]。
在基因工程的图1治疗用酶的广泛用途及代表性酶[4-7]
Figure 1 Wide range of therapeutic enzymes and representative enzymes[4-7]
帮助下，理想的蛋白质可被大量生产出来，从而满足酶工业的需要。迄今为止，重组DNA技术已经产生了上百种具有治疗性的酶制剂[11]。
2酶作为治疗药物的应用
治疗用酶现在已经成为许多重大疾病的有效治疗药物，如先天性缺酶症的治疗、血栓与冠心病的治疗以及抗肿瘤治疗等。据不完全统计，已在临床使用的酶类药物已经超过近百种，而酶类药物的制剂品种已经超过700种，图2中介绍了部分治疗用酶的治疗作用机制。
2.1癌症治疗
治疗酶在癌症中的应用涉及两种主要类型：肿瘤所需氨基酸代谢酶和前体药物转化酶。代谢酶被用来消耗肿瘤细胞所必需的氨基酸，从而抑制肿瘤生长；转化酶被用于在肿瘤细胞中将前药转化为细胞毒性药物，进而杀死肿瘤细胞。
2.1.1L-天冬酰胺酶
L-天冬酰胺酶是一种四聚体酶，能催化氨基酸L-天冬酰胺的水解。大多数正常的人类细胞都能够合成L-天冬酰胺，但某些恶性肿瘤细胞却不能合成，必须通过血液获得。因此，利用L-天冬酰胺酶代谢L-天冬酰胺，使恶性肿瘤细胞无法获得生长必需的天冬酰胺，从而抑制其生长[12]。L-天冬酰胺酶可以从各种各样的微生物(酵母、真菌、细菌)中提取，其中细菌来源的L-天冬酰胺酶应用较多[13]。
L-天冬酰胺酶在临床上对急性淋巴细胞性白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病及粒细胞性白血病的疗效比较好，对黑色素瘤也有一定作用[14]。其中，L-天冬酰胺酶对儿童的急性淋巴细胞性白血病效果较为突出，有效率为85.2%，完全缓解率为57.8%[15]。但使用L-天冬酰胺酶也存在一定的副作用，主要包括严重的过敏反应、恶心、呕吐、发烧、肾功能和肝功能受损等[16-17]。L-天冬酰胺酶与聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)偶联后可大大减少过敏反应，经少量梳状PEG衍生分子PM13和PM100修饰的L-天冬酰胺酶，在降低免疫反应的同时还能保持较高的酶活性[17-18]。此外，L-天冬酰胺酶还可与其他细胞毒药物合并应用，例如其可与长春新碱和皮质类固醇等药物联合来治疗急性淋巴细胞性白血病[18]。
2.1.2精氨酸脱亚胺酶
精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase，ADI)是一种能将精氨酸分解成瓜氨酸和氨的酶。正常情况下，体内精氨酸可由细胞自身的尿素循环酶即精氨酸代琥珀酸合成酶和精氨酸琥珀酸裂解酶合成[19]，但具有代谢缺陷的某些恶性肿瘤，如黑色素瘤、肺癌、前列腺癌和肝细胞癌则经常缺乏这些酶[20-22]。由于上述肿瘤细胞的生长依赖于环境中的精氨酸，所以ADI可用于治疗这些精氨酸营养缺陷型肿瘤。ADI被认为是一种比L-天冬酰胺酶好的白血病治疗药物，因为ADI对精氨酸具有高度特异性，不转化其他氨基酸，而L-天冬酰胺酶则是以天冬酰胺和谷氨酰胺为底物，在降解谷氨酰胺时会产生一些导致副作用的有毒物质[23]。ADI可从化脓性链球菌、类链球菌和支原体中提取到。
ADI虽然有较好的肿瘤杀伤力，但由于其强抗原性和循环半衰期短(半衰期为4 h)，在体内效果不明显[24]。经过20 kD聚乙二醇(PEG-20)修饰的ADI能够避开循环和驻留巨噬细胞，延长ADI半衰期并降低免疫原性。Feun等经研究指出，随着循环时间的增加，ADI-PEG-20在体内外均对精氨酸代琥珀酸合成酶阴性的癌细胞显示出了强大的抗肿瘤效果，Pheonix药物公司目前正在进行用ADI-PEG-20治疗晚期肝细胞性肝癌(II/III期)和黑色素瘤(I/II期)的临床试验，其中在肝癌治疗中已进入Ⅲ期临床[25]。此外，还有相关报道将ADI-PEG-20作为胰腺癌放射治疗的辅助手段，也可用于多形性胶质母细胞瘤及胸椎癌(间皮瘤和非小细胞肺癌)的治疗[23,26-30]。Cheng等通过蛋白质工程改变了PpADI(来自Pseudomonas plecoglossicida的ADI)突变体M31表面的氨基酸残基，将PpADI M31表面的4个精氨酸替换成赖氨酸，为其PEG图2部分治疗用酶的治疗作用机制
Figure 2 Therapeutic mechanism of partial therapeutic enzymes
注：A：L-天冬酰胺酶将L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸，从而阻止L-天冬酰胺供养肿瘤细胞；B：精氨酸脱亚胺酶将L-精氨酸水解成L-瓜氨酸，从而阻止L-精氨酸供养肿瘤细胞；C：谷氨酰胺酶将L-谷氨酰胺水解成L-谷氨酸，从而阻止L-谷氨酰胺供养肿瘤细胞；D：苯丙氨酸氨解酶将苯丙氨酸降解成反式肉桂酸，从而减少苯丙氨酸在体内的积累；E：葡糖糖氧化酶将葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2，从而达到杀死肿瘤细胞的目的；F：犬尿氨酸酶将犬尿氨酸水解成L-丙氨酸和邻氨基苯甲酸，从而激起人体免疫系统攻击肿瘤细胞；G：羧肽酶A将甲氨蝶呤-苯丙氨酸前药水解成甲氨蝶呤和L-苯丙氨酸，恢复甲氨蝶呤的细胞毒性.
Note:A:L-asparaginase hydrolyzes L-asparagine to L-aspartic acid,thus preventing feeding of L-asparagine to tumor cells;B:Arginine deiminase hydrolyzes L-arginine to L-citrulline,thus preventing feeding of L-arginine to tumor cells;C:Glutamine hydrolyzes L-glutamine to L-glutamic acid,thus preventing feeding of L-glutamine to tumor cells;D:Phenylalanine aminolyase degrades phenylalanine into trans-cinnamic acid,thus reducing the accumulation of phenylalanine in the body;E:Glucose oxidase oxidizes glucose into gluconic acid and H2O2,so as to kill tumor cells;F:Kynureninase hydrolyzes kynurenine into L-alanine and anthranilic acid,so as to stimulate the human immune system to attack tumor cells;G:Carboxypeptidase A hydrolyzes methotrexate phenylalanine prodrugs into methotrexate and L-phenylalanine,and restores the cytotoxicity of methotrexate.
修饰提供初级胺[31]。经研究得出通过将299和382位的精氨酸替换成赖氨酸(PpADI M36)，使PpADI M31的聚乙二醇化位点的平均数量从大约12个上升至大约20个，经聚乙二醇修饰的PpADI M36在人血清中的半衰期得到显著提升(PEG-M31：3.2 d；PEG-M36：4.8 d)[31]。
2.1.3谷氨酰胺酶
谷氨酰胺是一种参与多种代谢和能量转换的关键氨基酸，是哺乳动物体内主要的氮转运体，在能量产生方面起主要作用[32]。对癌细胞代谢的研究发现，致癌基因或肿瘤抑制基因的许多突变增加了参与谷氨酰胺代谢和摄取蛋白的表达，表明谷氨酰胺供应与肿瘤增殖之间存在很强的相关性[33-34]。因此，在氨基酸耗竭疗法中，谷氨酰胺酶似乎是一种适合的药物。
由于谷氨酰胺酶的稳定性差和Km值高，单纯的谷氨酰胺酶在体内外对肿瘤的生长和增殖均无明显抑制作用，但是从假单胞菌(Pseudomonas)7A中分离的谷氨酰胺酶与天冬酰胺酶联用时能治疗对天冬酰胺酶产生耐药性的淋巴瘤，对各种白血病也有一定的疗效[35]。
2.1.4前体药物激活酶
抗体导向酶-前体药物疗法(antibody-directed enzyme prodrug therapy，ADEPT)是一种利用转化酶作为癌症治疗剂的策略。在这种方法中，前体药物激活酶与单克隆抗体偶联，携带着酶到达肿瘤细胞[36]，无细胞毒性的前药在该酶的催化下将转化为细胞毒性药物，从而特异性地破坏癌细胞。这种方法正被用于发现和开发以激活前药的肿瘤靶向酶为基础的癌症治疗药物。有文献报道，经过修饰的羧肽酶A可以激活前药甲氨蝶呤-苯丙氨酸的活性，用于结肠癌的治疗[37]。人类β-葡萄糖醛酸酶也是一个有吸引力的酶类，其能激活前药葡萄糖苷酸[38]。
2.2先天性缺酶症的替代治疗
代谢途径中所涉及的酶的缺陷与许多病理条件有关。在这些情况下，为了弥补酶活性的损失，人们采取了各种策略，包括使用酶替代补充治疗(enzyme-replacement therapy，ERT)或药物分子伴侣作为结构稳定剂[39]。由表1可知，美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)已经批准了多种酶制品作为孤儿药物(用于预防、治疗、诊断罕见病的药品)，用于治疗多种遗传性缺酶症。有关孤儿药物治疗缺酶症的应用研究，我国开展得不多，值得引起重视。
2.2.1苯丙酮尿症
苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)是一种常见的遗传性代谢疾病，其特征是苯丙氨酸在体内的积累，原因是苯丙氨酸羟化酶的活性低或没有活性，不能催化苯丙氨酸转化为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积，并从尿中大量排出，其主要临床症状为智力低下、精神发育迟滞、湿疹、皮肤抓痕征及色素脱失和鼠气味；苯丙氨酸氨解酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)可以催化苯丙氨酸转化为无毒无害的反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸被进一步代谢最后以马尿酸的形式随尿液排出，由于PAL催化的反应生成无毒化合物，所以PAL被认为是治疗PKU的一种药物[40]。为了降低PAL的免疫原性，优化传递方式及酶的来源，Bell等对多种PAL进行评价，筛选出来源于Anabaena variabilis(Av)的PAL突变体AvPAL(Cys503Ser/Cys565Ser)，经PEG修饰后表现出阳性药效学特征和良好的表达效价[41]。目前，此种PAL已在2018年被FDA批准用于PKU的治疗。杨顺楷从土壤中选育出高PAL活性的红酵母属菌种CIBASA1401，由此菌种产生的PAL在无任何防腐剂和保护剂存在下，4°C保存1周后剩余酶活95%，在–20°C保存2周后剩余酶活82%，显著提高了PAL的稳定性[42]。此外，Codexis公司与雀巢公司通过蛋白质工程手段提高了PAL(CDX-6114)在消化道中的稳定性，使口服PAL成为可能。目前，CDX-6114正处于临床I期。Synlogic公司还利用合成生物学策略，构建了含有PAL等能代谢苯丙氨酸的益生菌，期望在肠道中使用该菌治疗苯丙酮尿症[43]。