摘要:目的建立有限取样法估算霉酚酸(MPA)在自身免疫性疾病(AID)患者的体内暴露药量(AUC)。方法24例AID患者，服用霉酚酸酯(MMF)0.75 g，q12 h，达稳态后，检测服药前即刻、服药后0.5，1，1.5，2，4，6，8和12 h活性代谢物MPA的血药浓度，梯形法计算各例实测AUC0-12 h;将24例患者数据资料随机平分为模型资料组与验证资料组，对模型资料组的数据采用多元线性回归法分别拟合1～4个采血点估算AUC0-12 h的数学模型，对初选模型用验证资料组数据检验预测偏差和精密度，并结合临床实际情况选择最佳模型。结果12 h谷浓度建立的单点预测模型r2值为0.957，平均预测误差及绝对预测误差分别为－3.93与11.93，均＜15%;0.5，1.5，6，8 h或1.5，6，8，12 h四点拟合的模型与AUC0-12 h的相关性均达0.996，验证后预测误差在±15%以内的例数为9例;另有2点模型与3点模型，预测效果介于上述两种模型之间。结论结合临床实际情况，精确度较高的四点模型AUC=3.19+0.49c0.5 h+1.76c1.5h+2.95c6 h+5.46c8 h适用于晨起服药后取血监测的住院患者;相对简便的单点模型AUC=10.82+13.37c12 h适用于夜间服药次日晨起入院监测的门诊患者。Bland-Altman分析显示，两种模型均能较好预测使用MMF+甲泼尼龙二联免疫抑制方案的中国成年AID患者的MPA AUC。
关键词:有限取样法;霉酚酸;自身免疫性疾病;药动学
霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)为免疫抑制剂霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)的体内活性代谢物，其可以选择性阻断T和B淋巴细胞的增殖，在器官移植以及自身免疫性疾病(autoimmune disease，AID)的治疗中发挥着重要作用。但由于其药动学及药效学存在极大的个体差异，临床治疗需要个体化给药。研究发现，MMF的治疗效果与MPA体内暴露药量(AUC)密切相关［1-2］，而常规AUC的监测需要全时程血药浓度-时间点(8～12个采血点)，并用梯形法计算，不仅繁琐、测定费用高，而且给患者带来不便和痛苦。因此，借助只需采测1～4个血样浓度即可准确预测AUC的有限取样法(Lim-ited sampling strategy，LSS)可以解决这一难题，应用LSS估算器官移植患者群体MPA AUC的报道已较广泛［3-4］，但在AID患者群体的报道较少，有限的一些国外报道结论并不一致［5］，由于MMF代谢酶基因多态性的种族差异，这些结论也不适用于国内种族群体。本试验对依从MMF+甲泼尼龙二联免疫抑制方案的24例中国成年AID患者进行了研究，在获取MPA全时程药动学的基础上，利用多元线性回归法拟合估算MPA AUC的有限取样模型，并对模型进行外部验证，以寻找准确、简便、实用的LSS指导MPA的个体化用药。
1材料与方法
1.1研究对象
选择2009年1月～2014年12月期间，在我院肾脏内科治疗的自身免疫性疾病患者24例(IgA肾病患者14例，狼疮性肾炎患者5例，血管炎相关肾病5例)，所有患者服用MMF的剂量均为每次0.75 g，q12 h，连续服药均＞7 d，甲泼尼龙约为0.32 g·d－1，大部分患者定期服用盖三淳与质子泵抑制剂以对抗糖皮质激素引发的骨质疏松及消化溃疡等副作用;试验过程中无病例死亡，有5例出现轻度感染，经抗生素治疗后好转，所有入组患者均完成本试验。试验方案获同济大学附属杨浦医院伦理委员会批准，患者在研究开始前自愿签署了知情同意书。
1.2药物与仪器
MMF胶囊(商品名:骁悉，规格:每粒0.25 g，批号:SH0089，上海罗氏制药有限公司);MPA对照品(上海罗氏制药有限公司，批号:L13111/b，纯度＞96%);内标卡马西平对照品(Sigma公司，批号为100142-199503，纯度＞98%);甲醇和乙腈均为色谱纯;试验用水为超纯水。
1500系列高效液相色谱仪(美国Waters公司，包括1525二元泵、2489紫外检测器、2707自动进样器、智能柱温箱、BreezeTM Software色谱工作站);MS204S型电子分析天平(瑞士梅特勒公司);超纯水仪(Synergy UV系统，美国Millipore公司);Allegra X－30Ｒ超速冷冻离心机(贝克曼库尔特有限公司);MIXEＲ-UZUSIO VTX－3000L旋涡混合器(上海飞域国际贸易有限公司)。
1.3血清样品采集
患者服药达稳态后，在研究当日清晨服药前即刻、服药后0.5，1，1.5，2，4，6，8和12 h采取血样3～5 mL，于4℃下4 000 r·min－1离心10 min，取上层血清再于同温度下12 000 r·min－1，离心10 min，取上层血清于－80℃保存。
1.4样品处理及测定
取待测血清100μL，加入100μL含有卡马西平(4 mg·L－1)的蛋白沉淀剂(3 g·L－1 ZnSO的甲醇溶液)，振荡20 s混匀;13 000 r·min－1，4℃，离心10 min，取上清液进样20μL，测定。
色谱柱:XBrigeTM C(4.6 mm×250 mm，5μm);流动相:20 mmol·L－1 NaH PO(用20%磷酸调至pH 3.0)-甲醇=45∶55;流速1.2 mL·min－1;检测波长304 nm;柱温45℃;进样量20μL。
该方法经体内药物分析方法学指标验证均符合生物样品测试要求，MPA在0.312 5～50 mg·L－1内线性良好，标准曲线方程式为Y=0.76ρ－0.16(Y为检测物与内标峰面积比值，ρ为MPA的质量浓度)，相关系数r=0.999 7，定量下限为0.3 mg·L－1，反复冻融3次，－70℃放置6个月以及室温放置24 h后，回收率均在90%～110%，ＲSD均＜10%。
1.5药动学参数计算
血药浓度直观图绘制，梯形法计算MPA AUC0-12 h应用EXCEL完成;c0 h，c12 h，cmax以及tmax均为实际测量值。模型资料组及验证资料组之间参数的比较，多元线性回归分析均通过SAS 6.0统计软件实施。
1.6 LSS模型的建立与验证
对模型资料组的参数，利用多元线性回归方法中的最优子集法，以决定系数r2最大为最优准则，分别以1～4个浓度点为自变量，遴选出r2排在前三位的多元线性方程，并代入验证资料组进行验证，计算平均预测误差(mean percentage prediction error，MPPE，代表模型准确性，见式1)和平均绝对预测误差(mean absolute percentage prediction error，MAPE，代表模型精密度，见式2)。
式1:MPPE=1∑(Pe)
式2:MAPE=1∑|Pe|
式中Pe=percentage prediction error=(AUC预测值－AUC实测值)/AUC实测值×100%，N为验证资料组患者例数。
考虑到谷浓度、峰浓度可能的影响，方案设计对0，1，12 h 3个点的MPA浓度进行取点建模估算MPA AUC;此外，还从药动学的角度，在分布相与消除相及交界处的1，4，8，12 h的血药浓度中模拟最佳取点时间;所得模型均记录r2并同上代入验证资料组验证。
模型筛选时，决定系数r2越接近1且验证后MPPE与MAPE均＜15%的多元线性回归方程视为达标模型用Bland-Altman分析法评估验证资料组MPA AUC0-12 h
实测值与运用回归方程预测的MPA AUC0-12 h的一致性，并结合临床实际情况选出最佳模型。
2结果
2.1患者的基本参数
24例成年AID患者进入药动学研究时的基线特征包括人口统计学资料、血常规、血生化和免疫学的相关指标，以及稳态服药后基本的药动学参数见表1，所有入组患者的病情都较稳定，模型资料组与验证资料组患者的参数对比结果显示，各项参数均无显著性差异P＞0.05)。
2.2 MPA的血药浓度-时间曲线
24例AID患者依从MMF 0.75 g，q12 h给药方案连续服药达稳态后的药-时曲线见图1。MPA在血清中的峰浓度出现于口服药物后的1～2 h，由于存在肠肝循环，大部分患者在服药后6～12 h会出现第二个，甚至第三个MPA浓度峰，c0 h，cmax，tmax变异程度很大，AUC0-12 h的平均值为46.02 mg·h·L－1，变化范围在10.28～148.00 mg·h·L－1之间。
2.3有限取样模型
对模型资料组的9点血药浓度及梯形法计算的实测MPA AUC0-12 h数据，采用多元线性回归法分别拟合1～4个采血点估算MPA AUC0-12 h的数学模型，遴选出决定系数r2较高的不同采血点的模型(#1～12)，同时对考察峰谷浓度影响的模型(#13～14)以及受药动学特征影响的模型(#15～17)，均应用验证资料组数据进行外部验证，结果见表2。由表2数据可见，在简便的单点MPA浓度预测组(#1～3)中，只有服药后12 h的谷浓度预测模型能够达到预测标准(MPPE与MAPE均＜15%)，其决定系数r2=0.957，MPPE及MAPE分别为－3.93与11.93;模型#4～12均可达到预测标准，但4个时间点的预测效果更接近实际计算结果，其中基于0.5，1.5，6，表1 24例服用MMF的成年AID患者的基线特征及基本药动学参数．n=24，x珋±s
Tab.1 Baseline characteristics and pharmacokinetic parameterof the 24 adult AID patients taking MMF．n=24，x珋±s
图1 24例成年AID患者MPA稳态的血药浓度-时间曲线Fig.1 Individual steady-state MPA concentrations after oral MMF for 24 adult AID patients
8 h或1.5，6，8，12 h的模型，决定系数r2均最高达到0.996，预测偏差在±15%的人数均最多(9/12)，但实际操作却较单点法繁琐;对于峰谷浓度监测构建的模型#13，在模型建立组以及验证组的表现均不理想(r2=0.859，MPPE及MAPE均＞15%)，引入12 h浓度点(#14)，效果大大改善，尤其在验证资料组，预测偏差在±15%的人数达到10人，但决定系数较模型#10等4点模型偏低;考虑到药动学特征的模型#16与#17呈现类似的结果。
2.4有限取样方案评价
用Bland-Altman分析法评价简便的单点模型1与在两组效果均较好的模型#10中AUC预测值和AUC实测值之间的一致性，结果见图2，只有少数值超出95%一致性界限，在临床上是可接受的误差范围。模型#10的平均误差为－0.24，更接近于0，说明此模型预测值与AUC实测值之间的一致性更高。
3讨论
器官移植患者MPA AUC与药效及不良反应之间的关系研究国内外均早有报道，目前普遍认为通过LSS对MPA进行治疗药物监测控制AUC在30～60 mg·h·L－1，有助减少排异反应、副作用和长期过度免疫抑制情况的发生［8］。随着MMF在AID患者的应用日益广泛，研究发现，MMF在AID患者群体的药动学个体差异极大，固定剂量给药难以产生良好的治疗效果，MPA的治疗窗也不同于器官移植患者，如Filler课题组［9］发现对于儿童AID患者有效的MPA AUC值为(61.8±31)mg·h·L－1，Neu-mann课题组［10］推荐成年AID患者MPA AUC值控制在40～75 mg·h·L－1，尽管对系统性红斑狼疮患者，有效的AUC治疗阈值还未被验证，可以肯定的是，MPA AUC的监测可以帮助AID患者改善临床疗效。国外已逐渐出现利用LSS建立监测AID患者MPA AUC的方法，有些研究还发现MPA AUC与服用MMF后12 h的MPA谷浓度相关性很高［11］，这也在本试验中得到进一步证实，这一点不同于器官移植患者群体，究其原因可能因为联合用药不同:器官移植患者常联合应用3～4种免疫抑制剂，如服用MMF常联合应用神经钙蛋白抑制剂如
表2预测MPA AUC0-12 h的有限取样模型
Tab.2 Limited sampling models for MPA AUC0-12 h prediction
图2 Bland-Altman分析法评价AUC实测值与模型#1或模型#10预测的AUC间的一致性
Fig.2 Bland-Altman plot for agreement between calculated 9-time MPA AUC0-12 h and model#1 or model#10-estimated MPA AUC
环孢素或他克莫司，环孢素可抑制肝肠循环，并增加MPA的清除率［12］，有研究甚至发现联合应用环孢素的比联合应用他克莫司的器官移植受者群体其MPA AUC与c12 h的相关性差［13］。而AID患者一般仅使用1～2种免疫抑制剂，本试验研究对象联合应用甲泼尼龙免疫抑制治疗。
治疗药物监测常取用服药前谷浓度作为实际检测指标，本试验却发现MPA AUC与c0 h的相关性并不佳(r2=0.383)，结合峰谷浓度的模型#13，预测效果也不达标，回顾研究发现，本药动学研究当日规定患者晨起服药后2 h再进餐，后续服用标准餐，但c0 h相当于前次夜晚给药的12 h浓度，而前次夜晚给药的饮食未受到控制，有些患者甚至晚餐时服药，由于食物对MMF吸收、分布、代谢具有不可忽视的影响［14］，造成本次药动学研究的c并不是真正的谷浓度，可以提供证明的数据是我们的研究对象中有不少患者的c0 h大于c12 h。
本次试验发现的AID群体中MPA AUC与c12 h的强相关性提示MMF的治疗药物监测可以只简单监测MPA c12 h，进一步的LSS研究发现，模型MPAAUC0-12 h=10.82+13.37c12 h
经外部验证准确性与精密度均可接受，Bland-Altman分析也显示了MPA AUC预测值与实测值之间的良好一致性，结合临床实际情况，此模型可按如下流程应用于门诊患者:医护人员在血药浓度监测前天应向患者进行用药教育，嘱其夜间按时服药，服药时间与进餐时间隔开2 h，且饮食尽量清淡，12 h后即第二天清晨空腹准时去医院抽血监测MPA的c12 h，即可准确预测MPA AUC。为了追求更精确的预测结果，LSS研究发现，2～4个点的优化模型均纳入了服药后6 h或6 h以后的采血点浓度，进一步证实了肝肠循环阶段的MPA浓度对AUC的影响较大，4点模型#10和#11的r2最高，且在验证资料组PE%落在±15%的人数亦较多，由于采样点相对较多，更适用于住院患者晨起服药后准时采样，鉴于模型#11中最后一个采样点在服药后的12 h，夜晚采样会影响到患者休息(模型#14～17虽预测效果较佳，也存在相似的问题)，在临床实际应用中推荐模型#10，即MPAAUC0-12 h=3.19+0.49c0.5 h+1.76c1.5 h+2.95c6 h+5.46c8 h。表2中预测效果达标的其他模型，也可根据患者的特殊情况灵活选用。
总之，接受MMF治疗的AID患者群体中，MPA AUC的监测有助于指导MMF的个体化给药。在国内，MMF治疗AID的个体化给药多凭经验，缺乏相应的科学依据，为改善AID患者服用MMF的治疗效果，本试验采用多元线性回归法首次对联合应用糖皮质激素的中国成年AID患者提供了预测MPA AUC的有限取样模型，并对模型进行了外部验证与Bland-Altman分析法评估，结合临床实际情况选择的模型便于操作，为使用MMF+甲泼尼龙二联方案的中国成年AID患者的个体化给药提供了有力工具。
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