[摘要]目的：建立高效、实用的癫痫患者苯巴比妥药物浓度监测方法，评价高效液相色谱（HPLC）法与化学发光微粒子免疫（CMIA）法的相关性和一致性。方法：分别采用HPLC法和CMIA法监测55例癫痫患者血浆中苯巴比妥的药物浓度，利用Passing-Bablok回归法、配对t检验法和Bland-Altman法分析，考察两种方法的相关性及一致性。结果：以两种方法的测定结果作回归方程为Y=1.024 1 X+0.349 2（r=0.988，n=55），显示两种方法相关性良好；配对t检验（P>0.05）和Bland-Altman法分析结果表明二者的一致性良好。结论：HPLC法和CMIA法监测癫痫患者血浆中苯巴比妥的药物浓度具有较好的相关性与一致性，可以相互替代，均可用于临床监测治疗药物浓度。
[关键词]高效液相色谱法；化学发光微粒子免疫法；苯巴比妥；治疗药物浓度监测；一致性
癫痫是一种常见的、慢性的神经系统疾病。苯巴比妥（phenobarbital，PB）是一种非选择性的中枢神经系统镇静剂[1]，是临床上常用的广谱抗癫痫药物，用于癫痫大发作和部分性发作的治疗，对儿童的抗癫痫治疗有效[2]，是新生儿癫痫的一线用药[3]。但其治疗窗较窄（15~40μg·mL-1），毒副作用大，其毒性与血药浓度具有密切相关性，因此在临床应用过程中，应加强对该药治疗药物浓度监测，以便达到最佳的治疗效果[4]。目前，文献报道监测苯巴比妥血药浓度常用的方法有以下几种：高效液相色谱（HPLC）法[4-6]、荧光偏振免疫分析（FPIA）法[7]、液相色谱串联质谱（LC-MS）法[8-9]、化学发光微粒子免疫（CMIA）法[10-11]等。CMIA法是基于免疫反应原理和化学发光原理的化学发光免疫分析方法，具有自动化程度高和灵敏度高等特点，在甲状腺功能、肿瘤标志物、药物检测等方面应用广泛[12]，适合临床常规监测，但试剂盒价格昂贵，不适于小样本量的应用。HPLC法已广泛应用于临床药物浓度的监测[4-6,13-14]，是药物分析中常规的方法。由于不同的药物浓度监测方法之间测定结果差异大，给临床治疗评价带来诸多不便，本研究以CMIA法为对照，采用HPLC法监测癫痫患者血浆中苯巴比妥的药物浓度，并评价二者的相关性及一致性。
1仪器与试药
LC-20A高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；Architect i2000SR全自动化学发光免疫分析仪，D-37520高速离心机（美国Abbott公司）；Vortex Genius 3漩涡混合器（德国IKA公司）；XS205DU电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ-600数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
苯巴比妥对照品（PB，中国食品药品检定研究院，批号171222-200605），苯妥英对照品（PT，中国食品药品检定研究院，批号101187-201001）。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他为分析纯。
患者血浆收集自2014年7月–2015年7月哈尔滨医科大学附属第一医院应用苯巴比妥的55例癫痫患者（年龄2个月~61岁），空腹抽取稳态谷浓度血样3 mL，涡旋混匀1 min，6000 r·min-1离心5 min，分离血浆，分成2份，一份于当日用CMIA法测定，另一份于–40℃低温冰箱保存备用，每月统一用HPLC法测定。空白血浆由志愿者提供。所有血浆样品均经哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会审定批准应用。
2方法与结果
2.1HPLC法
2.1.1色谱条件色谱柱：Hypersil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-水（47∶53）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：215 nm，240 nm；柱温：35℃；进样量：20μL。
2.1.2样品的处理取苯巴比妥对照品，精密称取10 mg，用适量甲醇配成浓度为1 000.0μg·mL-1的苯巴比妥对照品储备液。依次用甲醇稀释得到浓度为1 000.000、500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625μg·mL-1的系列浓度甲醇标准液。取50μL上述系列浓度甲醇标准液，各加入450μL空白血浆后涡旋混匀，即得对照品血浆系列样品。同法配制质量控制（QC）储备液（1 000μg·mL-1），于4℃冷藏。取苯妥英对照品，精密称取9 mg，用适量甲醇配成浓度为900μg·mL-1的储备液。
取血浆200μL，加入50μL内标液（苯妥英），涡旋30 s，加入600μL甲醇，涡旋120 s，离心5 min（15 000 r·min-1，4℃），取上清，0.22μm滤膜过滤后待分析。
2.1.3专属性考察分别取空白血浆、空白血浆含苯巴比妥标准品、空白血浆含内标液、空白血浆含苯巴比妥标准品及内标液、患者服药后血浆样品+内标液，采用“2.1.2”项下方法处理后进样20μL。获得色谱图，见图1。样品分离度及峰形良好，内源性杂质不干扰苯巴比妥的定量。
2.1.4标准曲线的绘制取对照品血浆系列样品，按“2.1.2”方法处理分析，以苯巴比妥峰面积/内标峰面积之比（Y）对苯巴比妥浓度（X）的回归方程为：Y=0.019 4 X+0.009 2（r=0.999，n=7）。线性范围为1.56~100.00μg·mL-1，线性关系良好。
图1高效液相色谱图
A–空白血浆，B–空白血浆+苯巴比妥标准品，C–空白血浆+内标液，D–空白血浆+苯巴比妥标准品+内标液，E–患者血浆+内标液；1–苯巴比妥，2–内标（苯妥英）
Fig 1 HPLC chromatograms
A–blank plasma,B–blank plasma with phenobarbital,C–blank plasma with internal standard,D–blank plasma with phenobarbital and internal standard,E–the patient's plasma samples with internal standard;1–phenobarbital,2–internal standard(phenytoin)
2.1.5方法回收率实验用空白血浆和苯巴比妥对照品溶液制成浓度分别为3.125、12.500、50.000μg·mL-1的样品各5份，按“2.1.2”项下方法操作后，进样分析，以测得值与实际值作比计算方法回收率。低、中、高3个浓度的方法回收率分别为（96.16±3.69）%、（100.01±2.77）%、（102.27±2.00）%，RSD分别为3.28%、2.40%、1.74%，回收率均在93.47%~104.27%之间，RSD≤3.28%，符合样品分析的要求。
2.1.6精密度实验日内精密度的测定：在一天内，用空白血浆与苯巴比妥对照品溶液制成浓度分别为3.125、12.500、50.000μg·mL-1的样品各5份，按“2.1.2”项下方法操作，进样分析，计算。日间精密度的测定：按“2.1.2”项下方法，连续测定5 d，同法计算。结果表明，日内精密度≤2.84%、日间精密度≤2.43%，样品的精密度符合体内药物分析的要求。
2.1.7稳定性实验用空白血浆和苯巴比妥对照品溶液制成浓度分别为3.125、12.500、50.000μg·mL-1的样品，按“2.1.2”项下方法处理。室温稳定性：样品于室温（25℃）放置4、8、12 h后，按“2.1.2”项下方法处理分析。长期冻融稳定性：样品于–40℃放置1、7、14、28 d后，取出融化完全后，按“2.1.2”项下方法处理计算。结果表明，RSD均在5%以内，在室温12 h内稳定性较好，反复冻融1个月内稳定性良好，符合样品分析要求，详见表1。
表1稳定性实验结果
Tab 1 Results of the stability test
2.1.8质量控制用空白血浆和苯巴比妥QC储备液配制成低、中、高3个浓度的样品，每个样品配制2份，按“2.1.2”项下方法处理，与待测血浆样品平行测定。质控样品结果偏差均小于20%，样品测定结果有效。
2.1.9患者血浆测定取待测血浆，按“2.1.2”项下方法进行前处理和上机分析，用相应的标准曲线计算患者血浆样品中苯巴比妥的含量。
2.2CMIA法
2.2.1CMIA法原理[12（]
Architect苯巴比妥测定试剂盒说明书）用吖啶酯标记的苯巴比妥分子作为酶竞争物，用苯巴比妥抗体包被的顺磁微粒子作为捕获物。检测样品时，将样本、苯巴比妥抗体包被的顺磁微粒子和吖啶酯标记的苯巴比妥结合物混合，制成反应混合物。苯巴比妥抗体包被的微粒子与样本中的吖啶酯标记的苯巴比妥结合物结合。冲洗后，将预激发液和激发液加入到反应混合物中，产生化学发光反应。测量产生的化学发光反应，以相对发光单位（RLUs）表示。
2.2.2标准曲线的制备采用美国雅培Architect i2000SR全自动化学发光免疫分析仪原装的标准定标液进行苯巴比妥标准曲线的制备。定标液的系列浓度分别为1.1、10.0、20.0、40.0、80.0μg·mL-1，仪器自动定标，自动拟合出标准曲线。
2.2.3性能指标的评估CMIA法的精密度、回收率、线性、灵敏度、特异性等性能指标均按照Architect系统操作手册执行，结果表明均符合测定要求。
2.2.4患者血样测定常规采血后，分离血浆，按照仪器标准操作规范测定，仪器自行取样、分析测定,每批血浆样本测定时需进行质控样品的平行测定。
2.3两种检测方法的比较
2.3.1方法CMIA法作为对照比较的检测系统，HPLC法作为待评价系统，以两种检测方法系统可重复性良好为前提。应用MedCalc（医学统计软件-英文版），采用相关分析、配对t检验和Bland-Altman法对两种方法的一致性进行评价。P<0.05为差异有统计学意义。
相关分析采用Passing-Bablok回归方法对两2.3.2种方法测定结果进行相关分析，以HPLC法测定癫痫患者血浆中苯巴比妥的浓度结果（Y）与CMIA法测定癫痫患者血浆中苯巴比妥的浓度结果（X）进行线性回归分析，得回归方程为：Y=1.024 1 X+0.349 2（r=0.988，n=55），方程的斜率为1.024 1（95%CI：0.986 9~1.062 8），截距为0.349 2（95%CI：–0.431 2~1.059 7）。结果显示，两种方法测定值之间存在着良好的相关关系（r>0.975），同时可认为该数据量和数据的分布范围达到统计学的要求。从相关性的结果分析，两种检测方法可以互相代替。
2.3.3一致性分析配对t检验：将测试样品苯巴比妥的HPLC法和CMIA法测定结果进行配对t检验，该药物血清浓度的HPLC法和CMIA法测定结果在统计学上无显著性差异（P>0.05）。
将两组测定值输入MedCalc软件进行Bland-Altman（B-A）分析[15]，结果如图2所示。横坐标X轴表示两种测定方法测定每个样本的平均值，纵坐标Y轴表示两种测定方法测定每个样本的差值与样本平均值的百分比。图中的上下两条水平虚线代表95%一致性界限的上下限，中间实线代表差值的百分比均数。两种分析方法的一致程度越高，实线越接近虚线。图中还显示了分析过程中出现的极端情况，是由偶然误差所造成的。
图2 HPLC与CMIA法偏差图
Fig 2 Deviation chart of HPLC and CMIA method
一般来说，B-A图形中，在置信区间上、下限内的点要占所有点的95%，并且上下限要在专业、临床可接受的临界值范围内。由图2可见，3.6%（2/55）的点在95%的一致性界限以外，达到要求；在一致性界限范围内，HPLC法苯巴比妥的检测值与CMIA法检测值相比，差值百分比的绝对值最大为20.1%，国家临检中心要求血浆样本血药浓度的检测限为±25%。因此，从一致性方面分析，HPLC法与CMIA法对苯巴比妥测定的结果一致性较好，两种方法可以互换。
3讨论
本研究所建立的HPLC法测定苯巴比妥血浆药物浓度，方法简便，专属性好、灵敏度高、准确可靠，更适用于小样本量的浓度监测，当样品量较大时建议仍采用CMIA法。本研究对两种分析方法进行了科学系统的方法学验证，两者的效能学指标均符合分析要求；对两种分析方法的测定结果进行了Passing-Bablok相关性分析[16-17]和Bland-Altman法的一致性评价及差别比较。
相关性分析结果显示，两种方法的相关性较好，具有可比性，可以互换。但相关分析评价两种检测结果具有明显的片面性。当系统误差较大时，相关分析也呈现较好的一致性，容易产生错误的结论，因为回归分析只能显示两种分析方法测定值之间的相关性及密切程度。因此，还需要进行一致性的评价和分析。常用测量定量数据两种检测方法的一致性评价
方法主要有以下几种：1）配对t检验：主要检验两组定量数据的集中位置是否一致，是国内一致性评价常用的方法[18]。只能反映均数的差异，不能兼顾随机误差和系统误差，只对系统误差比较敏感[19]。2）简单相关分析：即相关性分析，检验两组定量数据同步趋势相关关系的紧密程度。该方法对系统误差不敏感[19]。3）Bland-Altman方法（B-A法）：是国外学者于1986年提出的信度评价的一个重要方法[20]。该方法可通过图形直观的反应两组数据的一致性，兼容了系统误差和随机误差的考察，可结合临床实际意义，确定专业界限，具有独特的一致性评价优势[21]。B-A法的横、纵坐标可根据实际情况进行选择，可以是两种方法检测结果的差值或差值占均值的百分比。B-A法图中，95%的差值或差值占均值的百分比应该位于均值±1.96 SD之间，即位于95%的一致性界限之间的这个区间，考察这个区间以外数据点的数量以及区间以内的最大值和最小值，从测定方法的实际应用出发，判断差异是否可被接受为依据，从而得出是否具有一致性的评判。4）ATE/LER区域（allowable total error and limits for erroneous results zones）：该方法是FDA推荐的用来评价定量数据一致性的新方法。前2种方法评价一致性比较片面，后2种方法评价一致性时均结合了临床的实际意义进行判断，并兼顾两种误差，是具有优势的评价方法。
因此，我们采用B-A法进行二者的一致性评价，该方法验证结合图形，直观考察一致性界限外数据点的数量及界限内的最大值和最小值，从测量方法的临床应用出发，以测量结果的差异是否在临床上可被接受为依据，得出是否具有一致性的结论。
综上所述，本研究所建立的检测苯巴比妥药物浓度的HPLC法与CMIA法相关性和一致性良好，两种检测方法可以互换，均可用于临床血药浓度监测。另外，在评价两种临床检测手段时可采用Passing-Bablok相关性分析和Bland-Altman法进行一致性分析。
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