Caco-2细胞缺氧复氧损伤时母乳对促炎细胞因子表达的影响
王宇军 阮为勇 冯伟伟 步伟全 毕明远
南京中医药大学，江苏南京 210028
[摘要] 目的 研究母乳对坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis， NEC）炎症细胞的分子保护机制。 方法 通过建立Caco-2细胞缺氧复氧损伤模型，向正常细胞和缺氧复氧损伤模型细胞分别加入常规培养液、未加热乳清、加热灭活乳清。继续培养6 h后用ELISA法检测Caco-2细胞分泌于培养液中的促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。 结果 正常细胞组，未加热乳清和加热灭活乳清均可下调IL-1β、IL-6水平，未加热乳清较加热灭活乳清下调明显，两者之间差异有统计学意义；缺氧复氧损伤后IL-1β、IL-6、TNF-α均明显表达，未加热乳清和加热灭活乳清均可下调IL-1β、IL-6、TNF-α水平，差异有统计学意义，未加热乳清较加热灭活乳清下调IL-1β明显。 结论 母乳上清液可下调Caco-2炎症细胞促炎细胞因子IL-1β、IL-6的表达，尤其缺氧复氧损伤后TNF-α也下调明显，此类机制可能为母乳防治NEC的作用机制之一。
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关键词 坏死性小肠结肠炎；母乳；IL-1β；IL-6；TNF-α
[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１5）02（a）－０001-03
[基金来源] 江苏省中西医结合医院基金（RC1102）。
[作者简介] 王宇军（1975.1-），男，江苏南京人，本科，副主任医师，研究方向：小儿内科。
[通讯作者] 阮为勇，男，主任医师，研究方向：中西医结合小儿急救，邮箱：wyruan@126.com。
坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis， NEC）是新生儿尤其是早产儿时的严重胃肠道疾病，预后差，国内该病的病死率为10% ~50%[1]。研究证实，细胞凋亡是NEC早期肠上皮细胞死亡的主要形式，是NEC进一步发展的必经阶段[2]。肿瘤坏死因子-α、脂多糖内毒素、血小板活化因子等在NEC的发病中起重要作用[3]。尽管目前对NEC发病机制研究取得很大进展，但分子生物学机制还没完全阐明，缺乏特效的治疗手段[4]。本实验旨在通过母乳[5]干预Caco-2细胞缺氧复氧损伤， 研究其促炎细胞因子表达情况，探讨母乳防治NEC的作用机制，报道如下。
1 材料与方法
1.1 母乳成份上清液的提取
生后2~4 d的母乳(来自该院产科2012年6月—2013年12月正常分娩产妇)存于 4 ℃ 冰箱， 在24 h内处理， 12 000 r/ min离心10 min去除脂肪成分和细胞碎片， 保留乳清（未加热乳清）用于实验，通过煮沸5 min以灭活热敏感蛋白或多肽，再次12 000转/min离心10 min获得上清液为灭活乳清，未加热乳清和灭活乳清均存于-20 ℃ 冰箱备用。
1.2 Caco-2细胞培养
Caco-2细胞（细胞株购自中科院上海细胞库）适宜在37 ℃、5% CO2和90%相对湿度的环境中培养，采用DMEM培养基，包含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺和青霉素-链霉素双抗液。细胞培养在75 cm2培养瓶中，每5 d按1∶3的比例传代，传代后6~7 d细胞生长达到融合。
1.3 Caco-2细胞缺氧复氧损伤模型的建立
取传代后第6天生长达到融合的Caco-2细胞，吸去90%的培养液，以减少气体弥散距离，剩余培养液能维持细胞存活。将其置入密闭容器中，负压抽吸其中空气，换入高纯氮气，密闭后置入培养箱中孵育90 min(缺氧)，再取出，加培养液至原量，置入培养箱中孵育30 min(复氧)[6]。
1.4 实验分组
Caco-2细胞接种于6孔板，接种密度1×105/孔。分为正常细胞组和缺氧复氧损伤细胞组两大组，每组均分小组：A组为常规培养液组(MEM)；B组为未加热乳清组（以上制备的5% 乳清5%BM），C组为灭活乳清组（煮沸过的5%乳清5%BMb）。继续培养6 h后用ELISA法检测Caco-2细胞分泌于培养液中的促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。
1.5 统计方法
该研究数据采用SPSS 21.0软件包进行处理，计量资料采用均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法。
2 结果
与MEM正常细胞组相比，MEM缺氧复氧损伤组IL-1β、IL-6、TNF-α均明显表达，（t=16.112、9.468、6.593，P＜0.05）；正常细胞组中：单因素方差分析，IL-1β、IL-6表达均较常规培养液组有，差异有统计学意义（P＜0.05），TNF-α下降差异无统计学意义（P＞0.05），LSD法进一步两两比较，BM组IL-1β下降较BMb组更多，差异有统计学意义（P＜0.05），BM组和BMb 组IL-6差异无统计学意义（P＞0.05）。缺氧复氧损伤细胞组中：单因素方差分析，IL-1β、IL-6、TNF-α表达均较MEM组差异有统计学意义（P＜0.05），LSD法进一步两两比较，BM组IL-1β下降较BMb组更多，差异有统计学意义（P＜0.05），BM组和BMb 组之间的IL-6、TNF-α下降差异无统计学意义（P＞0.05）。Caco-2细胞分泌于各培养液中的促炎因子水平比较，见表1。
3 讨论
新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）是新生儿尤其是早产儿常见的消化道危急重症，其诊断和治疗仍然面临很多困难。迄今为止，NEC的病因及发病机制尚未完全明确，目前认为是由于早产、缺氧、低体温、喂养不当、肠道缺血、感染等多种因素综合作用所致。母乳喂养是一个保护因素，据报道人工喂养儿比母乳喂养儿NEC的发病率明显提高，因母乳含有多量的表皮生长因子等，能有效预防发生坏死性小肠结肠炎[7]。该实验中，体外培养了与人肠上皮细胞生物学功能相似的人结肠腺癌细胞系，从细胞及分子生物学水平进一步探讨母乳防治NEC的有效性及具体作用机制。
Caco-2细胞来源于人体结肠腺癌细胞，同源性好。由于Caco-2细胞在培养条件下可自发进行上皮样分化并可形成紧密联结，其形态学、标志酶的功能表达及渗透特征与小肠类似，可以作为研究小肠表皮细胞的药物转运、吸收和代谢的体外模型。因而被国内外大多数实验采用。
细胞因子是指主要由免疫细胞分泌的小分子多肽，具有介导和调节免疫、炎症和造血过程的功能，对机体感染、免疫应答、炎症以及创伤具有重要的调节作用。促炎细胞因子主要有IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ等。肠缺血/再灌注损伤是肠粘膜屏障功能损伤的常见原因，已经证实，缺血/再灌注可激活内皮细胞，引起局部细胞因子网络的失衡及某些细胞因子、粘附分子的过度表达，从而引起白细胞介导的组织损伤[8]。该实验缺氧复氧损伤细胞组促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α均明显表达，与文献报道一致，进一步证实细胞因子网络的失衡与NEC发病机制有关。
前期实验中，1%和5%母乳上清液对Caco-2炎症细胞均有抑制作用，后者作用略为明显，但差异无统计学意义（P>0.05），该实验综合考虑选择5%母乳上清液作为实验用浓度。正常细胞组，未加热乳清和加热灭活乳清均可下调IL-1β、IL-6水平，但下调TNF-α差异无统计学意义，未加热乳清较加热灭活乳清下调IL-1β明显，差异有统计学意义；缺氧复氧损伤细胞组，未加热乳清和灭活乳清均可下调IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具有统计学意义，未加热乳清较加热灭活乳清下调IL-1β更明显，差异有统计学意义。说明母乳可下调Caco-2炎症细胞促炎细胞因子（IL-1β、IL-6）的表达，尤其缺氧复氧损伤后下调均有统计学意义（IL-1β、IL-6、TNF-α），进一步证明此机制可能为母乳防治NEC的作用机制之一。母乳含有多种有生物学作用的有效成分，加热灭活热敏感蛋白或多肽可能影响这些成分的生物学作用，与未加热乳清比较，对IL-1β部分影响的差异有统计学意义，可能与采用的浓度相关，今后的研究可关注浓度含量的影响[9]。
NEC的发病机制复杂，研究表明可能与Toll样受体（Toll-like receptor， TLR）、核转录因子信号传导的异常激活等相关[10]。对细胞因子调控的分子机制，如母乳对肠上皮细胞核转录因子、Toll样受体表达如何影响，正在系列研究中将作进一步探讨。
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参考文献
[1] Hans Van Goudoever， 陈超，张蓉. 新生儿坏死性小肠结肠炎的热点问题[J].中国循证儿科杂志，2011， 6(5):321-323.
[2] Karatepe HO， Kilincaslan H， Berber M， et al. The effect of vascular endothelial growth factor overexpression in experimental necrotizing enterocolitis[J]. Pediatr Surg Int， 2014， 30(3):327-332.
[3] Yurttutan S， Ozdemir R， Canpolat FE， et a1. Beneficial effects of Etanercept on experimental necrotizing enterocolitis[J].Pediatr Surg Int， 2014， 30(1):71-77.
[4] Gane B， Bhat BV， Adhisivam B， et a1. Risk Factors and Outcome in Neonatal Necrotising Enterocolitis[J].Indian J Pediatr，2014，81(5):425-428.
[5] Kasivajjula H， Maheshwari A. Pathophysiology and Current Management of Necrotizing Enterocolitis[J]. Indian J Pediatr，2014，81(5):489-497.
[6] 孙炳伟， 赵小辰， 王广基，等. 缺氧复氧损伤后小肠上皮细胞刷状缘二肽转运载体生物学功能的改变及生长激素的调控作用[J].解放军医学杂志， 2003，28(11): 1025-1027.
[7] Gregory KE， Walker WA. Immunologic Factors in Human Milk and Disease Prevention in the Preterm Infant[J].Curr Pediatr Rep，2013，1(4):222-228.
[8] Geng Y，Li J，Wang F， et a1. Epidermal Growth Factor Promotes Proliferation and Improves Restoration After Intestinal Ischemia–Reperfusion Injury in Rats[J].Inflammation，2013，36(3):670-679.
[9] Liu Y， Fatheree NY， Mangalat N， et al. Lactobacillus reuteri strains reduce incidence and severity of experimental necrotizing enterocolitis via modulation of TLR4 and NF-kB signaling in the intestine[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2012， 302(6):G608-617.
[10] Winterberg T，Vieten G，Feldmann L， et al.Neonatal murine macrophages show enhanced chemotactic capacity upon toll-like receptor stimulation[J].Pediatr Surg Int，2014，30(2):159-164.
（收稿日期：2014-10-21）