方明麦柏坚舒建昌萧翠萍
【摘要】目的
通过体外药敏试验指导临床个体化用药治疗复发难治白血病。方法复发难治白血病患者随机分两组：按经验用药组以临床常规化疗方案进行化疗。按药敏结果指导用药组化疗前先抽取患者骨髓液分离白血病单个核细胞进行药敏试验，取敏感度强的药物组成相应的联合化疗方案，再按常规根据患者的体表面积计算剂量，并按常规方法给药。结果按药敏结果指导用药组在完全缓解（CR）率方面明显高于按经验用药组（p<0?05），在部分缓解（PR）率和未缓解（NR）率方面则未见差异。结论体外药物敏感性试验能够为临床化疗方案的选择提供参考,实现白血病化疗个体化,提高疗效,减少用药盲目性。
【关键词】敏感度药物体外白血病复发难治
【Abstract】ObjectiveUsing in vitro drug sensitivity testing to guide clinical individualized drug treatment of relapsed or refractory leukemia.
MethodsPatient with relapsed or refractory leukemia were randomly divided into two groups: in the control group, participants were treated by conventional chemotherapy which is according to clinical experience. In the treatment group, drug sensitivity test was performed by extracting leukemic mononuclear cells from the bone marrow and isolating them before the chemotherapy.Combine the drugs with high sensitivity in the chemotherapy. Then calculate the dose according to body surface area and administer it using conventional method.
ResultsThe CR result in the treatment group is significantly higher than the one in the control group (p<0?05). However the results of PR and NR did not have significant diversity.
ConclusionUsing in vitro drug sensitivity testing in clinical chemotherapy can achieve individualized chemotherapy for leukemia, improve efficacy and reduce medications being blindly.
【Key words】Sensitivity， Drug， In vitro， Leukemia， Relapse， Refractory
【Author′s address】Guangzhou Red Cross Hospital， Guangzhou， Guangdong， 510220 PRC
doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2014.06.003
白血病是目前严重威胁人们健康的一类疾病，化学治疗是治疗白血病的重要手段［1］。近些年来,化疗的疗效虽然大为提高,但由于白血病细胞存在异质性使其对不同化疗药物存在个体差异［2］,因此仅凭经验用药可能有些盲目性，特别是对复发难治的患者。尽管化疗在白血病的治疗中占有非常重要的地位，但是在临床实践中，化疗结果往往不尽如人意。我们在临床治疗中，会经常遇到白血病细胞耐药而影响疗效这个棘手的问题。有些患者一、二线药物都用了，仍不能控制病情，这时，怎样选择化疗药物就非常困难。目前临床上通常的做法是根据国际白血病临床试验的循证研究结果，得知不同的化疗药物对不同白血病的治疗敏感性，即每一种白血病相应的有效化疗药物敏感谱，从而经验性选择疗效最高的化疗药物组成方案进行治疗。但在临床上会碰到这种情况，经循证研究公认为对某种白血病有效的治疗方案，在有的患者身上却毫无效果，或疗效并不明显。这是因为白血病是一个异质性、多形态、分化程度不等的细胞群体。白血病对各种化疗药物的敏感性存在着明显的个体差异，即不同的白血病类型或同一类型的不同患者，甚至同一患者在不同的发病阶段，对化疗的敏感性也并不完全相同，治疗效果差别也很大。至今还没有一种或几种化疗药物的联合应用，能对某一种白血病100%有效［3］。
因此,为合理地对患者化疗敏感性进行评估，制定患者个体化化疗方案,我们对复发难治白血病患者做了白血病细胞的药敏试验， 为最大程度的发挥化疗的疗效提供重要的依据。尽可能实现临床的个体化用药，提高疗效，减少化疗药物的不良反应［4］，降低白血病细胞耐药性。
1资料与方法
1.1临床资料
我院于2008年1月~2011年6月收治的复发难治阶段的白血病患者62例，其中急性髓细胞白血病患者43例，急性淋巴细胞白血病患者19例，所有患者病情均符合急性白血病的诊断标准。无心、肺等重要脏器功能障碍，排除各类慢性白血病及由其他血液疾病转化而来的白血病。根据患者入院号的单双数情况将患者分为二组，每组31例。按经验用药组男17例，女14例，年龄15~67岁，平均年龄（34?5±2?6）岁;按药敏结果用药组男16例，女15例，年龄18~65岁，平均年龄（33?9±3?7）岁，两组患者的性别、年龄等未见显著性差异（p>0?05），具有可比性。
1.2药敏试验方法
1.2.1单个核细胞分离及计数①抽取患者骨髓液，在无菌条件下取标本2~3 ml，PBS等量稀释，充分混匀，小心缓慢沿管壁加至Ficoll分离液面上(Ficoll液:稀释液=1)，2 000 rpm，20 ℃，离心20 min。②将离心后的混合液处于中间层白色液面的单个核细胞小心抽取出，10%FBS RPMI 1640洗涤2次。③制备成10%FBS RPMI 1640细胞悬液。④进行细胞悬液计数：取10 ul标本，用PBS 390 ul稀释充分混匀后，取10 ul在计数板进行计数。
1.2.2单个核细胞培养将以上制备成10%FBS RPMI 1640单个核细胞悬液，接种5 000个细胞悬液100 μl于96孔板内，预先置于37 ℃，5% CO2饱和湿度培养箱内培养6 h。
1.2.3单个核细胞给药时间和药物浓度①确定要给的药物及该药的血药浓度，计算出96孔板中需给药物浓度和数量：拟进行检测的药物谱是依托泊苷，甲氨蝶呤，阿糖胞苷，表柔比星，吡柔比星，米托蒽醌，三尖杉酯碱，长春地辛，威猛，阿克拉霉素，去甲氧柔红霉素,左旋门冬酰胺酶。药物浓度按照常规剂量血液峰值配制，具体浓度可见各药物的说明书。②确定本项目给药后的时间点：2、6、12、24 h。③确定给药浓度。共分三级别：低，中，高；比值为1∶2∶4。将药物的血药浓度取为中值。同时设有对照和重复验证。④在给药后的各个时间点采用活细胞计数CCK-8试剂检测细胞增殖和毒性：在给药后的各个时间点，加入10 μl的CCK-8试剂到对应的每个孔内，培养箱内培养1 h后。用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度，参比波长为600 nm或600 nm以上。⑤根据所测得的OD值，分析10种药物作用下，四个时间点、三种不同浓度的单个核细胞的增殖和毒性，得出患者对各种药物的药敏情况。⑥同时还进行流式细胞凋亡/死亡检测（Annexin V/PI双染色法）。
1.3药敏结果的应用
药敏结果以敏感度强、中、弱表示，取敏感度强的药物组成相应的联合化疗方案，剂量按常规根据患者的体表面积计算，并按常规方法给药。
1.4疗效观察
化疗开始后记录患者在化疗期间出现的各种不良反应；疗程结束后3天复查心脏B超、心电图和生化指标，观察药物的毒性反应；疗程结束后14天复查骨髓像和外周血常规，观察骨髓和外周血的原始、幼稚细胞比例变化并分析细胞形态特征；临床疗效评定参照由中华医学会血液学会主编《血液病诊断标准及疗效标准（第三版）》，分完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、未缓解(NR)。毒副作用评定参照WHO标准；生活质量评定参照KPS计分。
1.5统计学处理
采用SPSS 18?0 for windows软件进行统计学处理，计数资料采用?2检验，有统计学意义的标准是p<0?05。
2结果
2.1临床疗效
参照药敏结果用药化疗的31例患者有17例CR，10例PR，4例NR。按经验用药化疗的31例患者有11例CR，13例PR，7例NR。两组复发难治白血病患者经治疗后在CR率方面具有显著性差异（p<0?05），在PR率和NR率方面则未见差异。见表1。
2.2两组患者治疗过程中不良反应情况
两组患者在化疗过程中出现的不良反应如胃肠道症状及心、肝、肾功能的检测指标和生活质量评定指标方面无明显的统计学差异。
3讨论
急性白血病是临床常见的严重威胁人类健康的血液系统恶性疾病，是骨髓原始细胞克隆性恶性增殖所致，具有高度的异质性［2］，临床上对其治疗具有较大难度。特别是难治复发病例，目前尚缺乏特异性的治疗方法和手段，疗效不尽如人意,即使采用大剂量化疗和造血干细胞移植治疗，大部分患者最终仍会死亡，因此，设法提高这部分患者的治疗效果是临床工作者经常思考的问题。由本组结果显示，体外药敏试验能够为临床化疗方案的选择提供参考,可以实现白血病化疗个体化,明显提高完全缓解率，增加疗效。
近30年来，各国学者对不同的恶性肿瘤疾病开发出多种抗肿瘤药物敏感性预测试验,以实现对肿瘤患者用药的合理化和化学治疗的个体化，这些评估化疗敏感性的方法通常分为体内试验和体外试验［5］。
体外药敏实验主要通过对肿瘤细胞进行分离（白血病细胞本身就是单个存在，分离起来要比实体肿瘤容易），加药培养,然后检测其对抗癌药物的敏感程度。根据检测方法不同可分为:四唑蓝快速比色法(MTT比色法);人体肿瘤细胞集落测定(HTCA);三磷酸腺苷生物发光法(ATP-CSA);琥珀酸脱氢酶抑制试验(SDI-T);同位素短期法(3H-TDR)等。体外药敏实验相对简便快速,经济,有较好的临床实用价值,近年来，由于分子、细胞生物学的发展，国内外学者都在不断寻找简便易行、准确可靠的化疗药物敏感性检测方法。其中利用原代肿瘤细胞培养的方法（也就是体外药敏），是迄今为止最为理想的方法之一［7］。该方法的特点是直接从患者体内获取新鲜的肿瘤组织（白血病细胞）进行首次培养，然后做药敏试验，由于肿瘤细胞刚刚离体，生物学性状尚未发生大的变化，能较真实地反映整个肿瘤细胞群体的特性及不同供体的个体差异，能够比较确切地代表体内状态。这种方法的体外药物敏感性试验能够为临床化疗方案的选择提供参考,实现白血病化疗个体化,提高疗效,减少用药盲目性及药物毒副作用，还可以减少不必要的药品浪费。
参考文献
［1］TSIFTSOGLOU A S，BONOVOLIAS I D，TSIFTSOGLOU S A.Multilevel targeting of hematopoietic stem cell self-renewal，differentiation and apoptosis for leukemia therapy［J］.Pharmacol Ther，2009,122(3):264-280.
［2］姚玉芹，薛重重，杨丽萍.CD40-CD40L与B细胞肿瘤治疗研究进展［J］.现代医院，2013,13(5):17-19.
［3］GUILHOT F，ROY L，TOMOWIAK C.Current treatment strategies in chronic myeloid leukemia［J］.Curr Opin Hematol,2012，19(2):102-109.
［4］周长华,张青,欧瑞明,等.急性髓系白血病应用G-CSF后对中性粒细胞碱性磷酸酶活性的影响［J］.现代医院,2013,13(3):13-14.
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