吕文涛1 褚晓杰2
1 大庆医学高等专科学校 黑龙江省大庆市 163012 2 大庆油田总医院临床药学科 黑龙江省大庆市 163012
【摘 要】目的：确定12-LOX/12-HETE 通路是否参与了缺氧抑制Kv 通道。方法: 本试验通过血管环技术在细胞水平上观察在12-LO 阻断剂CDC 和NDGA 作用下，缺氧对K ＋通道的影响, 并观察12 － HETE 对Kv 通道的作用是否具有特异性。结果: 我们发现抑制了12-LOX 的生成，同时苯肾上腺素引起的在缺氧条件下的肺动脉收缩也被抑制。在常氧和缺氧的条件下，12-LOX 被阻断同时也能引起电压门控性K(IKV) 通道电流的增加。结论: 上述结果表明，12-HETE 能使IKV 电流受到抑制能够抑制肺动脉血管的张力，证明内源性12-HETE 介导了缺氧对Kv 通道的抑制作用。
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关键词 12-HETE；缺氧；肺动脉平滑肌细胞；肺动脉
当机体长期缺氧时可引起肺动脉平滑肌细胞持续性收缩，最终形成肺动脉血压升高。但目前这一现象的机制尚未明确，有资料报导缺氧时细胞膜上的一个或多个Kv 通道，引发膜去极化，激活L- 型钙离子通道，升高细胞内钙离子浓度，导致血管平滑肌收缩。目前，缺氧对肺动脉平滑肌细胞的Kv 通道的抑制作用机制还未阐明，本研究讨论12-HETE 是否对Kv 通道具有抑制作用，从而引起肺动脉收缩，来阐述缺氧时诱发肺动脉高压的形成机制。
1 材料和动物
12-HETE、CDC、NDGA 购自Biomol公司。Kv1.5 通道兔多克隆抗体， 辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG 抗体购自美国Sigma 公司，RT-PCR 试剂盒购自Invitrogen 公司，其他试剂均为国产分析纯。动物模型为实验室自制。
2 试验方法
2.1 肺动脉的培养和肺血管张力的测定
取体重200 g ～ 250 g 的Wistar 雄性大鼠，水合氯醛麻醉后取肺，置于4℃ Krebs液中分离肺动脉血管, 在显微镜下分离大鼠远端肺动脉剔除相连组织，并清除血管内皮。将肺动脉直接加入有20% 血清的DMEM 培养液培养48 小时，并按以下条件分组： (1) 缺氧组 (2.5% O2/5% CO2/ 其余N2)，(2) 缺氧+ 30 μmol?L-1NDGA，血管环的研究，在显微镜下分离大鼠远端肺动脉≈ 0.5 to 1.5 mm 直径。血管被放在有0.005英寸直径的钨勾的血管环仪器上进行血管张力的测量，初始负荷张力为0.3 g. 平衡三十分钟后，在缺氧的条件下加入PE（10-9to 10-5 mol?L-1）每隔两分钟记录血管张力的变化。在缺氧的条件下，对比有NDGA药物孵育的血管和没有NDGA 药物孵育的血管，加入PE 比较张力变化。肺动脉环的舒缩张力信号通过八通道生物信号分析系统传输到计算机上相应处理软件进行数据记录和分析。
2.2 统计学处理
数据均用mean±SD 表示，组间比较用ANOVA 检验，对组间有差别的项目两组间比较用Dunnett´s 检验。P < 0.05 为有统计学意义P < 0.01 为有显著意义。
3 结果
3.1 在缺氧的条件下肺动脉血管张力的研究
在缺氧的条件下内源性 12-HETE 对肺血管张力的影响（内槽恒温37℃左右）。在30 min 内逐渐增大肺动脉环负荷至0.3g, 作为负荷值。动脉环在37℃的Krebs 液中平衡40 min。在肺动脉缺氧的条件下加入PE，确定10-6 mol?L-1 为最佳反应浓度.10-6 mol?L-1-PE 缺氧中比较血管在缺氧和加上12-HETE 阻断剂的差异。发现在血管被阻断剂孵育48 小时后与对照组有较大差异。在血管被阻断剂孵育48 小时后，在脂氧酶抑制剂（NDGA）存在的条件下，PE引起血管收缩反应可看出在下缺氧组和阻断剂组有差异 ( 图1)。
3.2 在大鼠肺动脉平滑肌细胞中在常氧和缺氧的条件下12-LOX 的阻断剂对IKv 的影响
为了区分IK 的成分IKV 和 IBKca 我们分别用5 mmol?L-1 TEA 和5 mmol?L-1 4-AP两种通道阻断剂。首先 TEA 被用来阻断BKCa 通道来观察内源性12-HETE 对 Kv电流的影响。结果显示，在缺氧的条件下( 图2) 和在常氧条件下 ( 图3) 阻断了内源性12-HETE的生成部分抑制了IKV 的电流。进一步说明缺氧的条件下30 μmol/L NDGA抑制了内源性12-HETE 的生成IKV 电流增加。显示12-LOX/12-HETE 信号通路参与了12-HETE 抑制IKV 的过程 ( 图2I，图3Q)。相反，在缺氧和常氧条件下内源性12-HETE 被抑制 IBKca 电流变化不明显。
4 讨论
在缺氧的条件下，肺动脉血管环试验中，苯肾上腺素引起的血管收缩反应中发现，在血管被阻断剂孵育48 小时后与对照组有较大差异， 所有的结果显示导缺氧致肺动脉收是通过内源性12-HETE 的调节机制。而通过这些研究并不能辨别那些Kv 通道亚型参与了此种调节机制。血管环实验能证明缺氧抑制 Kv 通道是通过12-HETE 的调节机制。表明了在缺氧的条件下在大鼠肺动脉中，12-HETE 能使IKv 电流受到抑制能够抑制肺动脉血管的张力。内源性12-HETE 在缺氧性肺动脉收缩中其到重要的调节作用。这些研究使我们第一次在缺氧抑制Kv 通道中，建立了分子和离子通道机制，对今后的研究提供了实验依据。
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参考文献
[1] 崔英春， 张捷， 刘庆鑫等.12s-HETE 对大鼠系膜细胞和肾小球内p27kip1 表达的影响[J]. 中国免疫学，2009（12）：1067-1069.
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[3] Stefan ， K . ， E duardo ， M . V . ， J o s é ，R.L.，Pérez-García，M.T.，2005.Down regulation of Kv3.4 channels by chronic hypoxia increases acute oxygen sensitivity in rabbit carotid body.J.Physiol.395-408.
作者简介
吕文涛（1981-）男，硕士研究生学历。现为大庆医学高等专科学校讲师。