杨志业1 刘文斌2
1.广东省食品药品检验所，广东广州 510180；2.广州市药品检验所一分所，广东广州 510130
[摘要] 目的 建立倒扣草TLC指纹图谱及测定药材中β-蜕皮甾酮含量，为控制药材质量提供科学依据。方法 利用TLC法建立倒扣草药材指纹图谱，采用RP-HPLC法测定β-蜕皮甾酮含量。结果 不同产地倒扣草TLC 指纹图谱中显示有6个共有斑点作为倒扣草的特征成分，这6个斑点可用于药材的定性鉴别，不同批次药材中β-蜕皮甾酮的含量差异较大。结论 TLC 指纹图谱鉴别结合β-蜕皮甾酮含量测定能较全面反映倒扣草药材质量 ，可用于药材质量控制。
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关键词 ] 倒扣草；指纹图谱；β-蜕皮甾酮；含量测定
[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）03（c）-0152-02
倒扣草为两广地区民间常用中草药，始载于《岭南采药录》，来源于苋科植物土牛膝Achyranthes aspera L.的干燥全草，具有解表清热，利水通淋，活血散瘀的功效，用于感冒发热，暑热头痛，湿温病久热不退，疟疾寒热往来，乳娥，热淋，小便不利[1]。全草含倒扣草碱（ahyranthine）、β-蜕皮甾酮（β-ecdysterone）、甜菜碱（betaine），种子含皂苷约1%，主要为倒扣草皂苷A（asperasaponin A）、倒扣草皂苷B（asperasaponin B）。根含皂苷，其苷元均为齐墩果酸。药理研究表明齐墩果酸[2]具有消炎、增强免疫、抑制血小板降集、降糖、抗氧化和利尿等多方面作用，还具有护肝、抗高血脂、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等生物活性；β-蜕皮甾酮( β-ecdysterone，EDS) 为三萜甾酮类成分，研究表明蜕皮甾酮[3]可以促进肝细胞的氨基酸摄取，促进人体内蛋白质合成，降血脂，降胆固醇，抑制血糖上升的生物活性。近年来，有关倒扣草药材显微鉴别[4]及含量测定[5]均有报道，但结合TLC 指纹图谱定性鉴别和HPLC含量测定对其进行质量评价尚未见报道。本研究对倒扣草药材TLC 指纹图鉴别方法进行系统考察和优化，利用RP-HPLC法测定药材中β-蜕皮甾酮含量，旨在为控制倒扣草药材质量提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1仪器
硅胶G预制板 20cm×10cm（Merck），自动点样仪（ATS4，CAMAG），薄层色谱成像仪（Reprostar 3，CAMAG）；Waters2695/2487高效液相色谱仪；天平：Sartorius CP225D电子天平；KQ-300DA超声波清洗机（功率300W，频率40kHz）；BINDER电热干燥箱。
1.2 试药
β-蜕皮甾酮对照品（中国药品生物制品检定所，110709-201206）；乙腈为色谱纯试剂，甲酸为化学纯试剂，水为超纯水。倒扣草11批，样品编号：1（产地：广西）；2（产地：广西）；3（产地：广东）；4（产地：湖南）；5（产地：广东）；6（产地：广西）；7（产地：湖北）；8（产地：广东）；9（产地：广东）；10（产地：湖南）；倒扣草对照药材自采于广东罗浮山。各样品及对照药材基源均经广东省食品药品检验所林惠蓉主任中药师鉴定。
2 方法与结果
2.1 TLC指纹图谱鉴别
2.1.1 供试品溶液制备 取倒扣草药材粉末（过三号筛）约2 g，加乙醇25 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，用乙醇2 mL溶解，置中性氧化铝柱（100～200目，4g，内径1~1.5 cm）上，用70%甲醇25 mL洗脱。收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。
2.1.2 对照药材溶液制备 取倒扣草对照药材粉末（过三号筛）约2 g，按“2.1.1”项下制备，即得。
2.1.3 对照品溶液制备 取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，即得。
2.1.4 色谱条件 吸取供试品溶液及对照药材溶液、对照品溶液各2μL，分别点于同一薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:4:0.5）为展开剂，展开8cm，取出，晾干；喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光（366nm）下观察荧光色谱，并摄制图片（图1）。
S：齐墩果酸； 1~10：样品（No.1~No.10）；11：对照药材。
图1 倒扣草药材TLC指纹图谱
2.2 β-蜕皮甾酮含量测定
2.2.1 色谱条件 Kromasil 100-5C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5?m）；流动相：乙腈－0.1%甲酸溶液（13：87）；检测波长为250nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：20?l，理论板数按β-蜕皮甾酮峰计算，应不低于5000。对照品和样品色谱见图2。
A：对照品；B：样品；1. β-蜕皮甾酮
图2 倒扣草药材HPLC图
2.2.2 对照品贮备液 精密称取β-蜕皮甾酮对照品10mg，加甲醇制成浓度为100.34μg/mL的溶液，作为对照品贮备液。
2.2.3 对照品溶液 精密吸取“2.2.2”项下的对照品贮备液1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。
2.2.4 供试品溶液 取本品粉末（过三号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇25 mL，称定重量，充分振摇后超声（功率300W，频率40kHz）处理30 min，放冷，再称定重量，用水饱和正丁醇补足减失的重量，滤过，精密取续滤液10 mL，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.2.5 线性关系考察 精密称取“2.2.2”项下的对照品贮备液适量，加甲醇制成每1mL分别含5.017、10.034、20.068、40.136、60.204 μg/mL的系列对照品溶液。按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰峰面积。以进样量（X,ng）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，得回归方程：Y=1998.8X-5.9459，r=1.0000。结果表明β-蜕皮甾酮在0.0502～0.6020?g范围内呈良好线性关系。
2.2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果RSD为1.1%，表明仪器精密度良好。
2.2.7 重复性试验 取同一批号的供试品，按“2.2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样测定。结果β-蜕皮甾酮的平均含量为0.25mg/g，RSD为1.6%（n=6），表明本方法重复性良好。
2.2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0，2，5，10，15，24h进样10μL，记录峰面积。结果RSD为0.8%。表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.2.9 加样回收率试验 取同一批供试品，分低中高3个水平进行加样回收率考察，每个水平各取3份，低水平取样量为0.1g，中水平取样量为0.3g，高水平取样量为0.5g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入β-蜕皮甾酮对照品25.09μg，80.28μg，120.41μg。按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。结果β-蜕皮甾酮低水平平均回收率为101.4%，RSD为0.4%；中水平平均回收率为100.7%，RSD为1.3%；高水平平均回收率为98.2%，RSD为1.8%。表明该方法回收率良好。结果，见表1。
2.2.10样品含量测定 取本品，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，计算样品中β-蜕皮甾酮的含量，结果见表2。
表2 倒扣草中β-蜕皮甾酮含量测定结果
3 讨论
3.1 TLC条件选择
对不同比例的甲苯-乙酸乙酯-甲酸、甲苯-乙酸乙酯、甲醇-乙酸乙酯等展开剂进行考察，结果表明甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:4:0.5）对各组分的分离效果最佳。对不同显色检视方法，如紫外光254nm、紫外光365nm、10%硫酸乙醇溶液、5%AlCl3乙醇溶液等进行比较，结果表明喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光366nm下检视的方法效果最好。同时比较了不同温度（4℃；26℃），不同湿度（32%，60%，88%）下薄层效果，结果表明相对湿度对分离度影响不大，方法耐用性好。
3.2 TLC指纹图谱鉴别
不同产地倒扣草药材TLC指纹图谱中，从齐墩果酸（图1f）条斑向上，可以明显观察到6个共有斑点（图1），不同样品各共有荧光斑点的大小和强弱存在差异，表明样品中相应组分的相对含量不同。在显色后紫外光（366nm）的TLC途中，所分析的10批样品都可以观察到这6个斑点，因此这6个荧光斑点代表倒扣草的特征性成分，可用于药材的定性鉴别。
3.3 液相色谱条件选择
用乙腈-0.1%磷酸溶液，乙腈-0.1%甲酸溶液，甲醇-水等溶剂系统进行试验，结果显示乙腈-0.1%甲酸（18:87）对供试品溶液有较好的分离性能，色谱峰对称性好。比较了Kromasil 100-5C18、SHISEIDO C18、Agilent Zorbax SB C18等多种品牌的色谱柱，结果各色谱柱所得待测成分色谱峰峰形好，分离理想，表明方法耐用性好。
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参考文献]
[1] 广东省食品药品监督管理局编著. 广东省中药材标准[S].第一册.广东科技出版社,2004:162.
[2] 潘杭君,孙红祥.三萜皂苷的免疫调节作用[J].中兽医学杂志,2003,(1):42-45.
[3] 肖培根. 新编中药志[M].北京:化学工业出版社, 2003:l94-200.
[4] 欧丽兰,朱烨, 张椿,等.倒扣草的生药鉴定[J].中药材，2011,34(8):1199-1203.
[5] 欧丽兰, 张春,朱烨.HPLC法测定倒扣草中蜕皮甾酮的含量[J].云南中医中药杂志，2011,32(4):68-69.
（收稿日期：2014-01-11）