杨 宇1 陈 梦2 张美琴2 张宇平2 吕思航2
1.沈阳医学院生理学教研室,辽宁沈阳 110034；2.沈阳医学院临床医学系2011级学生，辽宁沈阳 110034
[摘要] 目的 通过建立脊髓神经损失大鼠模型探讨内源性下行抑制易化系统与5-羟色胺（5-HT)对脊髓伤害感受性信息的作用机制。方法 将40只大鼠随机分为正常对照组、假性手术组、模型组及针刺组，每组10只，通过分支结扎将腓总神经和左侧坐骨神经干胫神经切断，将坐骨神经剥离，保留腓总神经，并在术后1、2、3、7、14、28d采用Weatern bloting 测定各组大鼠脊髓背角和背神经中5-HT蛋白表达水平。结果 模型组大鼠脊髓背角和背神经中5-HT蛋白（286.3±22.7）％、（178.9±14.8）％于术后2d显著高于模型组假性手术组（64.3±14.2）％、（42.3±4.3）％，而针刺组大鼠脊髓背角和背神经中5-HT蛋白（142.3±21.3）％、（102.3±11.3）％显著下降，差异有统计学意义（P<0.05)。结论 脊髓背角和背神经中5-HT蛋白缺失可能与脊髓神经损伤疼痛有关，通过针刺脊髓能促使脊髓背角和背神经中5-HT蛋白表达，从而抑制脊髓伤害后疼痛刺激的传导，对预防神经病理性疼痛具有重要的作用。
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关键词 ] 脊髓神经损失；5-羟色胺；感受性信息
[中图分类号] R338 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）03（c）-0020-02
5-羟色胺（5-HT)是下行抑制系统参与机体镇痛作用的主要神经性活性物质，下行抑制系统是外周损害性信息向中枢神经系统传导的重要结构，脊髓背角层是下行抑制系统重要组成元件[1]。该系统主要由脑干中缝核簇、导水管周围灰质及相邻网状结构组成。5-HT可密集分布在背角胶层内，且5-HT可通过与不同受体结合作用于不同脊角浅层传递伤信息性神经元伤害中从而起到抑制神经痛觉传导的作用[2]。为此本文通过建立脊髓神经损失大鼠模型探讨内源性下抑制易化系统与5-羟色胺（5-HT)对脊髓伤害感受性信息的作用机制及针刺对疼痛传导的影响，旨在为临床神经疼痛性疾病的防治提供实验依据。
1材料及方法
1.1动物及分组
2013年1月—2013年12月选取40只Wistar成年健康雄性大鼠（由沈阳医学院实验动物中心提供），体重为（250±10）g，昼夜节律适应性饲养1周，室温控制在（25±1）℃。随机将大鼠分为分为正常对照组、假性手术组、模型组及针刺组，每组各10只Wistar大鼠。
1.2 模型的建立
通过分支结扎将腓总神经和左侧坐骨神经干胫神经切断，将坐骨神经剥离，保留腓总神经建立大鼠脊髓损伤模型，术前常规禁食6~8h，术前30 min分别肌内注射0.5mg阿托品（郑州羚锐制药股份有限公司，规格 1mL:0.5mg,产品批号0907201,），0.01g鲁米那钠（上海新亚药业有限公司生产,批号040921），对照组只做麻醉处理，麻醉后静置60 min。假手术组：麻醉后开膛后在坐骨神经下穿线，不损伤腓总神经和左侧坐骨神经干胫神经。模型组：麻醉后分支结扎将腓总神经和左侧坐骨神经干胫神经切断，将坐骨神经剥离，保留腓总神经。针刺组：针刺内关穴5 d后实施麻醉，操作与模型组相同。
1.3 针刺方法
根据《实验针灸学》[3]中大鼠穴位针灸方法从而拟对比人体取内关穴（即位于大鼠桡、尺骨缝中，前臂下1/6折点位置，采用医用30号毫针刺激内关穴位1~2 mm，并留针1 min，共30 min，1次/d，持续针刺5 d。
1.4 Western bloting 检测
术后1、2、3、7、14、28d每组分别抽取健康状况良好的5只大鼠抽取C5~T1阶段的脊髓背角和背神经中静脉血液5 mL，并在4℃环境中以1200r/min的速度离心处理15 min，留取上清液。采用由美国Pierce公司提供BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取40ug总蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜及封闭实验，并加入由博士德公司提供的5-HT抗体进行孵育震荡过夜。次日将膜取出经TBS漂洗后加入美国Gell signaling公司提供的羊抗兔二抗于室温下孵育1h，采用ECL发光法进行漂洗染色。同时采用Image 1 36b软件测定蛋白条带灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。
1.5 统计学分析
应用SPSS 17.0软件对结果进行分析，计量资料采用均数标准差（x±s）表示，组间均值的比较采用t检验，进一步的两两比较采用LSD﹣t法，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2结果
模型组大鼠脊髓背角和背神经中5-HT蛋白于术后1、2、3、7、14、28d显著高于模型组假性手术组（t=3.589,3.228,3.784,3.227,3.142和t=3.992,4.025,3.726,3.821,3.116），而针刺组大鼠脊髓背角和背神经中5-HT蛋白显著下降（t=4.263,4.022,4.079,3.256,3.215和t=4.021,4.258,3.778,3.982,3.441），差异有统计学意义（P<0.05)，见表1。
3讨论
5-HT是机体内源性活性物质，5-HT不仅能参与机体免疫及炎症反应，同时还能参与机体中纵多病理疾病的生理过程，当机体出现体内免疫反应及受损时可导致机体5-HT大量释放，并作用于效应细胞受体中，并引起炎症反应[4]。此外，当机体生理状态出现改变时，机体中5-HT也可大量释放，并直接或间接参与机体相关调控，从而使得机体出现生理病理性改变。相关研究指出[5]，机体内源下行系统调控完整性与5-HT参与机体信号传导具有重要的作用。刘希江[6]等认为5-HT可通过5-HT受体作用于阻抗性伤害性冲动传导，并降低疼痛敏感性，从而减少疼痛对机体的伤害。本研究通过建立脊髓神经损失大鼠模型探讨内源性下抑制易化系统与5-羟色胺（5-HT)对脊髓伤害感受性信息的作用机制，结果显示模型组大鼠脊髓背角和背神经中5-HT蛋白（286.3±22.7）％、（178.9±14.8）％于术后2 d显著高于模型组假性手术组（64.3±14.2）％、（42.3±4.3）％，而针刺组大鼠脊髓背角和背神经中5-HT蛋白（142.3±21.3）％、（102.3±11.3）％显著下降，差异有统计学意义（P<0.05)，从而表明脊髓背角和背神经中5-HT蛋白缺失可能与脊髓神经损伤疼痛有关，通过针刺脊髓能促使脊髓背角和背神经中5-HT蛋白表达，从而抑制脊髓伤害后疼痛刺激的传导。
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参考文献]
[1] 刘希江,曹菲,卜慧莲，等.胫骨癌痛大鼠脊髓背角5-羟色胺水平的变化[J].中华麻醉学杂志,2011,31(6):695-698.
[2] 甄龙,徐改玲,甄英伟，等.神经病理性疼痛患者血清BDNF,5-HT水平[J].神经疾病与精神卫生,2013,13(2):154-157.
[3] 王巍,邵晓丹,邵宝盛，等.“三才刺”对肾绞痛患者血浆、尿液中P物质、5-羟色胺水平的影响[J].针刺研究,2013,38(2):152-157.
[4] 杨娜娜,王熠钊,周宁，等.5-HT2A和5-HT2C受体与脊髓运动功能以及疼痛关系的研究进展[J].中华物理医学与康复杂志,2013,35(9):740-743.
[5] 门凌,张洪钦.治偏痛胶囊治疗偏头痛的疗效及对血浆5-羟色胺的影响[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(13):336-339.
[6] 刘希江,曹菲,卜慧莲，等.紫杉醇诱导神经病理性疼痛大鼠脊髓背角5-羟色胺含量变化[J].临床麻醉学杂志,2012,28(3):262-264.
（收稿日期：2013-12-20）