王顺旺1 叶水龙1 许文勇1 刘文娟1 徐 平2
1.厦门市第三医院神经内科，福建厦门 361100； 2.遵义医学院附属医院，贵州遵义 563003
[摘要] 目的 探讨反式白藜芦醇（TR，Trans-Resveratrol）对Aβ25-35损伤大鼠海马NMDA受体NR1、NR2A亚基表达的影响。方法 选择经莫式水迷宫(MWM)训练合格的大鼠，随机分为6组：假手术组；模型组；TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组、安理申对照组。模型组通过在大鼠海马内注射Aβ25-35制模获得，在模型组基础上分别用TR高、中、低剂量TR干预获得TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组，同时用安理申干预获得安理申对照组，每组6只，采用实时聚合酶链反应法(real time PCR)检测6组大鼠海马NMDA受体NR1、NR2A表达。 结果 在MWM中模型组逃避潜伏期比TR高、中、低剂量组、安理申组和假手术组明显延长，各组NMDA受体NR1表达分别为(0.14±0.04), (1.51±0.54), (0.22±0.06), (0.37±0.08,0.61) ± 0.15)(LOW)，(0.97±0.16)(安理申)。各组NMDA受体NR2A表达分别为(0.12±0.07)、(1.72±0.34)、(0.16±0.06)、(0.21±0.08)、(0.52±0.15)、(0.67±0.16)。结论 TR可能有下调海马NMDAR1 、NMDAR2A受体表达，从而减少海马细胞凋亡的作用。
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关键词 反式白藜芦醇；痴呆；大鼠；NMDA受体
[中图分类号] R725 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１4）09（c）－０011-03
海马是学习记忆的重要脑区，是边缘系统的一个部分[1]。NMDA受体是谷氨酸受体的一种亚型，参与形成突触传递的长时增强过程，参与调解神经系统的发育，同时在癫痫、肿瘤等多种重要过程中发挥重要作用[2-3]。目前已经发现的NMDA受体多达7种，包括NR1、NR2（A、B、C和D4种）、NR3（A、B2种），NR2各亚单位之间具有很好的相似性，一般将其分为2种亚群[4]。研究表明，反式白藜芦醇(Trans-Resveratrol, TR)具有一定的抗氧化作用，在防止高血压、动脉硬化及提高机体免疫力方面有较好的效果[5]。
研究发现，利用基因敲除技术敲除NR1基因后，小鼠CA1区NMDA受体兴奋性突触后电位消失，痴呆大鼠的海马突触传递发生改变，其海马的NR2A表达轻度上调，NR1表达明显上调。经TR干预后海马及附近脑组织NR1、NR2A表达均下调[9]。因此，我们使用颅钻钻孔微注棒Aβ25-35注射损伤双侧大鼠海马[7-8] ,注射TR后，观察其对痴呆大鼠保护的效果，并检测NMDA受体NR1、NR2A的表达情况，以探求临床上痴呆病人理想药物治疗的实验研究方法，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
实验用36只雄性大鼠为本单位实验动物研究中心提供，体重208~225 g，平均体重215 g。反式白藜芦醇(TR)粉剂购自西安林禾生物技术有限公司。苦味酸购自生工生物工程（上海）有限公司，盐酸多奈哌齐（安理申）购自卫材（中国）药业有限公司，Aβ25-35购自SIGMA公司，逆转录试剂、荧光液Green Supermix等PCR试剂购自生工生物工程（上海）有限公司。
1.2 仪器
冷冻离心机（德国5417R）、紫外可见分光光度计（TU-1810）、湘仪 H1650-W离心机，Thermo Piko Real 96 Real-time system实时PCR仪，Bioer XP Cycler普通PCR仪、双臂脑立体定位仪（68002型RWD life science co）、颅钻（78001型）、超微量注射棒、Morris水迷宫等。
1.3 动物模型制备
选择经莫式水迷宫(MWM)训练合格的大鼠，随机分为6组：假手术组；模型组；TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组、安理申对照组。模型组通过在大鼠海马内注射Aβ25-35制模获得，在模型组基础上分别用TR高、中、低剂量TR干预获得TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组，同时用安理申干预获得安理申对照组。
1.4 NMDA受体NR1、NR2A表达检测
利用RT-PCR检测NMDA受体NR1、NR2A的表达，方法参照检测试剂盒进行，PCR反应条件采用两步法进行,具体步骤为：95 ℃，3 min； 65 ℃，3 min。
1.5 统计方法
应用SPSS18.0统计软件分析所有数据，计量资料以（x±s）表示，组间比较用Levene 检验分析。
2 结果
2．1 各组NMDA受体NR1、NR2A表达
各组NRI及NR2A的表达结果见表1，与模型组相比，各组NR1及NR2A的表达差异有统计学意义（P＜0.05），且高剂量组反式白藜芦醇干预组的NR1的表达明显减少，与中、低剂量反式白藜芦醇干预组相比效果好。
2.2 TR各剂量组海马凋亡细胞病理观察
TR各剂量组海马凋亡细胞病理切片结果如图1所示，TR高剂量组海马的凋亡细胞数明显低于TR低剂量组、对照组及模型组，TR低剂量组海马凋亡细胞数相对对照组及模型组较少。
3 讨论
海马是人类脑部的重要区域，具有调解神经系统的发育的重要作用，是边缘系统的一个部分，海马受损是引起阿尔茨海默病的主要病因[6-7]。
NMDA受体是谷氨酸受体的一种亚型，参与形成突触传递的长时增强过程，研究发现当海马神经元突触内NMDA受体被阻断时，细胞变性死亡将会增加[8-10]。海马中主要表达的NMDA受体有NR1和NR2A，NR1可以在细胞中单独表达有功能的同聚受体，但对激动反应很小，NR2A不能单独形成有功能的通道，只有和NR1组合才能表现活性，并使后者反应明显加强，所以把NR1、NR2A放一起研究并起互相印证的作用[11-13]，研究发现，谷氨酸可能在神经病理变化及痴呆症状中起重要作用，在有痴呆的大鼠甘氨酸结合能力降低,提示NMDA受体的功能缺损，Lu等[15]采用免疫印迹法分析AD 患者死后脑NR1下降39% ,NR2B下降40%，提示NMDA受体的功能缺失后, AD患者嗅内皮质中NR1mRNA含量较正常人下降34%，而用用高压液相色谱分析脑组织标本中的右旋- 天冬氨酸含量发现[16] AD患者的天冬氨酸较相同年龄正常对照组下降，但在神经病理变化较小的小脑中无明显变化，这些说明右旋-天冬氨酸的降低可能参与NMDA受体功能下调及记忆丧失的过程。Hasanein等[17]则发现AD患者神经受损区具有特异性，Aβ25-35 在AD患者脑内堆集、产生神经毒性可能是通过NMDA受体促进氧自由基的生成所引起的[18]，所以该实验通过检测NMDA受体含量变化，推测抗氧化药物白藜芦醇是否对痴呆大鼠有作用，结果发现随着TR剂量的增加，海马组织NMDA受体的表达减少，痴呆症状有所改善，TR对痴呆大鼠海马起到保护作用，TR对大脑海马的保护作用可能是通过下调海马中NMDA受体NR1及N2A的表达完成的，但其具体作用机制还需要进一步研究发现。
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参考文献
[1] 王燕.白藜芦醇的生物学功能及其应用前景[J].中国饲料, 2006(16):22-24.
[2] Muralidharan P, V.R. Kumar and G. Balamurugan, Protective effect of Morinda citrifolia fruits on beta-amyloid (25-35) induced cognitive dysfunction in mice: an experimental and biochemical study[J].Phytother Res, 2010，24(2): 252-258.
[3] Danysz W.CG Parsons, Alzheimer´s disease, beta-amyloid, glutamate, NMDA receptors and memantine--searching for the connections[J].Br J Pharmacol, 2012，167(2):324-352.
[4] Liu Z.NR2B-containing NMDA receptors expression and their relationship to apoptosis in hippocampus of Alzheimer´s disease-like rats[J].Neurochem Res, 2012，37(7): 1420-1427.
[5] Adams, M.M., J.H. Morrison and A.C. Gore, N-methyl-D-aspartate receptor mRNA levels change during reproductive senescence in the hippocampus of female rats[J].Exp Neurol, 2001,170(1): 171-179.
[6] 刘小莉,陈虹.阿尔茨海默病动物模型研究概况[J].山东医药, 2007(11):76-77.
[7] 杨晓娟.新型复合式老年痴呆动物模型的建立[J].中西医结合心脑血管病杂志, 2006(4):318-320.
[8] 陈怡,李明,王庆山.白藜芦醇对中枢神经系统保护作用的研究进展[J].武警医学, 2006(10): 780-782.
[9] 李明.白藜芦醇抑制大鼠海马CA1区神经元放电(英文)[J].生理学报, 2005(3):355-360.
[10] 林奕斌, 赵同军,展永.N-甲基-D-天氡氨酸受体的分子结构与生理功能[J].生物学杂志, 2007(1):1-4.
[11] Lipton S A. The molecular basis of memantine action in Alzheimer´s disease and other neurologic disorders: low-affinity, uncompetitive antagonism[J].Curr Alzheimer Res, 2005,2(2):155-165.
[12] 黄春桃, 吴锡南，刘苹.N-甲基-D-天冬氨酸受体在中枢神经系统的研究进展[J].中国行为医学科学, 2006(4):377-378.
[13] Vanhoutte P,H Bading.Opposing roles of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in neuronal calcium signalling and BDNF gene regulation[J].Curr Opin Neurobiol, 2003,13(3):366-371.
[14] Shankar G M.Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway[J].J Neurosci,2007,27(11):2866-2875.
[15] Lu L. Differential long-term neuroadaptations of glutamate receptors in the basolateral and central amygdala after withdrawal from cocaine self-administration in rats[J].J Neurochem, 2005,94(1):161-168.
[16] Hosoya K. Blood-brain barrier produces significant efflux of L-aspartic acid but not D-aspartic acid: in vivo evidence using the brain efflux index method[J].J Neurochem, 1999,73(3):1206-1211.
[17] Hansen H H.Mechanisms leading to disseminated apoptosis following NMDA receptor blockade in the developing rat brain[J].Neurobiol Dis,2004,16(2): 440-453.
（收稿日期：2014-06-24）