黄新育?1，许英一?2，李 红?1，柴 华?1，杨伟光?1，杨 曌?1，高海娟?1，徐婷婷?1?
（1.黑龙江省畜牧研究所 161005；2. 齐齐哈尔大学食品与生物工程学院 161006）
摘要：该研究以北方寒冷地区龙牧801苜蓿鲜草为原料，用酸化加热法提取苜蓿叶蛋白。研究提取温度、提取液pH值、提取时间三因素对苜蓿叶蛋白提取率的影响。在单因素实验基础上，采用三因素三水平正交试验确定酸热法提取苜蓿叶蛋白的最佳工艺条件为：提取温度为60℃、pH值为4.0、提取时间为12 min，在此工艺条件下，粗蛋白提取率为45.32%。?
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关键词 ：苜蓿；叶蛋白；提取工艺
紫花苜蓿为豆科苜蓿属多年生草本植物[1]。苜蓿叶产量高，叶的蛋白质含量高，是叶蛋白生产中常用的原料[2-3]。苜蓿叶蛋白被认为是一种高质量的食品[4]，同时可用于饲料[5]和医药[3]等方面，而且苜蓿叶蛋白的应用领域正在不断拓宽[6-9]。叶蛋白的生产通常包括汁液提取、蛋白絮凝与分离和干燥这三个主要步骤[10]， 每个步骤对叶蛋白的提取率和产品质量影响都很大， 其中叶蛋白的絮凝最为关键[11]。叶蛋白的絮凝方法有加热法、酸碱度法、发酵法、溶剂浸提法等[12-13]。本试验主要是以优质新鲜的苜蓿叶为原料，研究酸与温度综合处理对叶蛋白提取率的影响，以寻求最佳的提取途径。 ?
1 材料与方法?
1.1 实验材料与试剂?
龙牧801苜蓿现蕾期[14-15]鲜草取自黑龙江省畜牧研究所试验田；氯化钠、盐酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸均为分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心。?
1.2 实验仪器?
DS?1 高速组织捣碎机：上海标本模型厂；80?1台式低速离心机：江苏省金坛市医疗仪器厂；PHS?25（数显）pH计：上海精密科学仪器有限公司；FD?1真空冷冻干燥机：上海豫康科教仪器设备有限公司；SHZ?B水浴恒温振荡器：上海跃进医疗器械厂；GZX?DH.400BS电热恒温干燥箱：上海跃进医疗器械厂。 ?
1.3 测定方法?
1.3.1 测定?
蛋白质含量的测定采用微量凯氏定氮法[16]。?
1.3.2 苜蓿叶蛋白提取率的计算?
酸热法[17]提取苜蓿叶蛋白采用半微量凯氏定氮法测其中的蛋白质含量。叶蛋白提取率按如下公式计算：?
1.4 实验方法?
1.4.1 酸热法提取苜蓿叶蛋白的工艺?
将苜蓿鲜叶剪切成长度约为1cm的小段[18]，采用鲜叶与2%的食盐溶液重量比为1∶2进行打浆2min。过滤后取滤液，对汁液调不同的pH值，置于水浴振荡器中加热絮凝，以5000r/min离心?20min，得到叶蛋白。将叶蛋白置于真空冷冻干燥机烘干，即得到叶蛋白粉。测定提取率。?
1.4.2 酸热法提取苜蓿叶蛋白工艺的优化研究?
本实验着重考察提取液pH值、提取温度、提取时间三因素对紫花苜蓿叶蛋白提取率的影响。在单因素试验的基础上，设计三因素三水平的正交试验[19]对酸热法提取紫花苜蓿叶蛋白的工艺进行优化研究。?
2 结果与分析?
由表1极差分析结果可得出，按照极差R的大小，影响粗蛋白提取率的主次因素的顺序为B（提取温度）＞C（提取时间）＞A（pH值），通过正交试验确定最佳组合为A2B3C3，即pH值为4.0，提取温度为60℃，提取时间为12 min。由方差分析表2可知，提取温度对粗蛋白提取率显著影响（P＜0.05），提取时间和pH值对粗蛋白提取率影响较小，这与极差分析的结果一致。由粗蛋白提取率大小还可以看出，正交表中直观表现最佳组合为A1B3C3，与正交结果不符，进行验证试验后得出，组合A2B3C3的粗蛋白提取率为45.32%，大于A1B3C3的粗蛋白提取率，说明通过正交试验能够产生最佳的试验组合。?
3 结论?
本实验酸热法提取苜蓿叶蛋白。利用蛋白质在酸作用下能变性沉淀的特性，将pH值调节至一定的酸性条件，以产生较好的絮凝效果，以提取苜蓿叶蛋白。本研究利用正交实验确定了酸热法提取苜蓿叶蛋白的最佳工艺条件为：提取温度为60℃、pH值为4.0、提取时间为12 min，在此工艺条件下，粗蛋白提取率为45.32%。??
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