赵楠
（山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，
山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东烟台264003）
基金项目：（1）国家科技支撑计划项目（2012BAD55G01），（2）国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2012AA10A406），（3）烟台市科技发展计划项目（2013LGS002）
作者简介：赵楠（1984-），男，汉族，大学本科，助理工程师，13583522617，zzzznnnnzzzz@hotmail.com
DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2015.03.003
摘要：传统的海带配子体种质资源保存是用锥形瓶保存，纸盖封口，但由于近些年来污染比较严重，所保存的海带配子体附着大量的细菌和各种杂藻，对克隆生长有很大的影响。为了更有效地保存海带种质资源，我们实验了三种不同的封口方式进行培养，探求其对克隆生长状态的影响。结果证明，最有效的封口方式为：滤纸膜的封口方式，不论是对配子体细胞状态，还是对克隆增殖都要好于其它方式。
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关键词 ：海带配子体克隆；种质资源保存；封口方式；滤纸膜
海带配子体克隆种质资源保存在海带种质资源保护、海带遗传育种和海带苗种繁育中起到至关重要的作用[1-2]。传统的海带配子体种质资源保存是用锥形瓶保存，用纸盖封口。由于近几年环境污染比较严重，海洋污染也很严重，每年从海上带回来的带有成熟孢子囊的海带附着大量的细菌和各种杂藻。在经过采集分离培养后，用纸盖封口一段时候后发现海带配子体长菌情况比较严重，对克隆生长有很大的影响。另外，采用传统保存方式的海带配子体克隆，保存在一个半开放环境中，比较容易受到外界环境污染，也不能保证拥有良好的状态。为了更有效地保存海带种质资源，我们实验了纸盖封口、封口膜封口、滤纸膜封口三种不同的封口方式对克隆生长状态的影响。
1材料
选取的实验材料为901杂交海带的雄性配子体克隆，它是一个比较有代表性的材料，抗逆性比较强[3]。
2方法
2.1实验相关的消毒方法
种质保存的条件之一就是相对无污染，故实验所用材料和物品初始需要相应的消毒或灭菌。
2.1.1实验材料的消毒实验用的901杂交海带的雄性配子体是使用无菌培养技术得来[4]。
2.1.2实验封口材料的消毒封口用的材料和消毒或灭菌处理方式分别是：纸盖为普通的纸张，经过烘箱120℃，2h高温处理；封口膜为Parafilm封口膜，其具有一定的水汽通透性能和很强的抗腐蚀性能，因为其材料特性，我们通过75%酒精浸泡15min处理；滤纸膜为市售滤纸膜经过120℃，20min蒸汽高压灭菌后，再经过烘箱120℃，2小时高温处理。
2.1.3培养液的消毒采用煮沸的海水，向其添加N(10mg/L)、P(1mg/L)，配制成培养液，再经过120℃，20min蒸汽高压灭菌处理。
2.2实验方法
在传统海带配子体克隆种质资源保存过程中，一般会定期更换培养液。更换培养液的周期一般为30d左右。
为了拥有一个良好的初始状态，我们先用超声波粉碎仪将一定量的901杂交海带的雄性配子体克隆簇打碎成较短的细胞段[5]，多次更换培养液后，再经过5d的自然光生长恢复，将其平均分到6个100mL的锥形瓶中，分别用纸盖、封口膜、滤纸膜来封口，每组两瓶。每种封口方式都设有一个空白对照。经过粉碎恢复后的克隆细胞状态尚可，细胞舒展，颜色正常，且菌量明显很少（见图1）。实验在10℃，1500lx的条件下进行，这是目前较为适宜海带配子体细胞生长的条件。
在实验过程中，我们持续观察了3个周期后，不同封口方式的克隆生长状态有了明显的区别。实验期间，每个更换培养液周期都会镜检4次，依前面所说30d为一个周期，每周观察一次。
3结果
在第一个更换培养液周期的前两周基本看不出有什么较大的区别，配子体克隆细胞状态也都正常。但在这个周期末，第四次镜检观察时，我们发现封口膜封口和滤纸膜封口的克隆状态还好，没有什么差异。纸盖封口的克隆生长状态尚好，但是菌量比其他两种封口方式的要多，且有不少细菌附在克隆生长出来的枝条上（见图2）。
在第二个更换培养周期内，我们发现封口膜封口和滤纸膜封口的克隆状态出现较为明显的差异。其中封口膜封口的克隆，在肉眼观察的条件下，克隆抱团，且颜色较深，而滤纸膜封口的较为正常；纸盖封口的克隆生长状态相比上个周期，没有明显变化，但菌量增多，比其他两种封口方式的依旧要多。
在第三个更换培养液周期里直到实验结束，纸盖封口的克隆菌量比较多，有些细胞被菌包围，影响生长最后死亡，但整体状态还好。没有被细菌附着的地方长势不错。（见图3）。封口膜封口的克隆相对干净，但克隆不是很伸展，有不少细胞慢慢膨大然后色素消退最后导致细胞死亡（见图4）。滤纸膜封口的克隆长势不错，比较干净，膨大死亡的细胞很少（见图5）。
经过三个周期的持续观察，得出的结果是用滤纸膜封口培养克隆比较理想。克隆生长状态不会受太大的影响，也不会有很多的细菌附着在克隆上束缚克隆的伸展。色素鲜亮，细胞膨大现象基本没有。
称重的结果见表1。
可见，滤纸膜对于配子体克隆细胞生长是最好的封口方式。
4分析
通过实验结果来看，滤纸膜封口培养克隆比较理想，这可能与其水气通透性有关。既保证了一定的气体通过性，使得瓶内气体可以有效地和外界空气交换，光合作用产生的气体也可以顺利排出；与外界保有一定的隔离，使得外界的污染物不容易混入瓶内。以上两点可以满足配子体克隆细胞健康地生长。封口膜具有一定的水汽通透性，但是，在每次换水时都可以看到封口的内侧有较多水珠，这说明瓶内部的气体无法及时排出，也可侧面说明氧气无法进入，抑制了配子体克隆的呼吸作用。与其他两种封口方式相比，封口膜特点就是其相对的封闭性，这也导致了配子体克隆生长过程中的状态不够舒展，部分细胞畸形，颜色加深，呈深褐色。作为传统的保存方式，纸盖较好的开放性，保证了配子体克隆生长对空气的需求，但是，过度的开放导致了外界污染物进入，最终形成优势种群，影响了配子体克隆的生长。
综上所述，滤纸膜保存配子体克隆，应该是目前液相常规保存法三种封口方式中最佳的选择。
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参考文献：
[1]
张全胜，罗世菊.海带种质保存技术的研究现状和发展前景[J].水产科技情报，2006，3(2)：61-63
[2]杨官品，李晓捷，丛义周，等.海带配子体无性繁殖(克隆)技术研究与应用进展.中国海洋大学学报，2007，37(4)：569-572
[3]李晓捷，王国文，张全胜，等.温度对“901”海带配子体克隆生长的影响[J].水产科技情报，2004，31(4)：166-168
[4]张壮志，钱瑞，罗世菊，等.海带种质保存防污染技术[J].河北渔业，2010（5）：30-31
[5]刘涛，朱明壮，包振民，等.超声波对海带配子体克隆的作用[J].海洋湖沼通报，2000(4)：39-44
（收稿日期：2015-02-14）