孟庆君，高原，吕娜
（内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地，内蒙古通辽028042）
摘要：粪肠球菌与多种感染相关，明胶酶是其主要毒力因子之一，它影响粪肠球菌毒力，与粪肠球菌生物被膜形成有关。现对gelE在生物被膜形成中的作用进行综述。
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关键词 ：粪肠球菌；明胶酶；生物被膜
中图分类号：S85 文献标志码：A 论文编号：2014-0542
0 引言
肠球菌早已被确认为条件性致病菌，经常参与伤口感染、腹腔内脓肿以及泌尿道、胆道、根管感染，主要见于免疫力低下或过量使用抗生素的患者[1]，也可以导致败血症、心内膜炎等从而危及生命，死亡率达21.0%~27.5%[2]。在过去的几十年中，肠球菌已成为越来越严重的医院病原体，部分原因是它普遍的多重抗生素耐药性[3]。除了溶细胞素，其本身对广泛的原核和真核细胞是致命的，在粪肠球菌中已发现几个毒力相关因子，包括聚集物质(Agg)、肠球菌表面蛋白(Esp)以及2 个胞外蛋白酶：明胶酶(gelatinase，gelE)和丝氨酸蛋白酶(sprE)[4]。这些因子之间协同作用，促进细菌寄居、迁移和生物被膜的形成，从而增强其毒力。在特定条件下细菌能够形成生物被膜，从而增强对抗生素和宿主免疫系统的抵抗力，引起感染性疾病。生物被膜形成机制的研究发现密度感应系统(QS)的调控有重要作用，gelE基因作为肠球菌主要QS 系统之一的fsr系统调控的下游基因，其编码的蛋白(gelE)与粪肠球菌生物被膜形成的关系亦受到重视[5]。gelE和sprE编码在同一个操纵子上，gelE-sprE，其表达由fsr位点编码的密度感应系统进行调节[6]。文章对粪肠球菌主要毒力因子gelE，及其在生物膜形成过程中的作用进行综述。
1 细菌生物被膜
细菌生物被膜是指细菌黏附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等，将其自身包裹其中而形成的大量细菌聚集膜样物，主要由细菌、高水化的多阴离子基质及被俘获的体外的大分子组成。生物被膜是细菌的一种具有保护性的生长模式，具有结构和代谢复杂性。在特定的条件下，细菌可以形成生物被膜，包被有生物被膜的细菌称为被膜菌。被膜菌无论其形态结构、生理生化特性、致病性还是对环境因子的敏感性等都与浮游细菌有显著的不同，尤其对抗生素和宿主免疫系统具有很强的抵抗力，从而导致严重的临床问题，引起许多慢性和难治性感染疾病的反复发作。细菌生物被膜粘附在各种医疗器械及导管上极难清除，以至引发大量的医源性感染。
细菌生物被膜的致病特点包括病灶局部的炎症反应不很强烈，感染有相互转化的静止期和发作期；抗菌药物治疗起初可能有效，但以后治疗常常失败；致病菌主要是来自皮肤和周围环境中的致病菌如金黄色葡萄球菌，粪肠球菌等。
2 生物被膜形成
生物被膜的形成是一个复杂的动态过程，其形成过程可分为3 个阶段：初始粘附阶段、聚集阶段和生物被膜成熟阶段。其中初始粘附是生物被膜形成的第1阶段，细菌最终能否粘附于表面取决于细菌与粘附表面接触面积足够大和两接触面之间所产生的吸附力大于排斥力。细菌粘附主要是通过细菌表面特定的粘素蛋白识别宿主表面受体来完成，具有特异性和选择性。接触表面的蛋白、糖蛋白和糖脂可作为受体，选择性地吸附特定种类的细菌。细菌粘附可分为可逆粘附和不可逆粘附2 个阶段，在可逆附着阶段影响其附着作用力较弱，主要为范德华力、静电力、疏水作用等；在不可逆附着阶段，细胞通过它的运输器官和附属肢体如鞭毛、纤毛和胞外多聚糖纤维等来达到接触表面。细菌粘附于表面后即调整基因表达，在生长繁殖的同时分泌大量的胞外多聚糖(exopolysaccharide,EPS)，包裹、粘附细胞逐渐形成微生物群落。细菌外多聚基质包裹是生物被膜成熟阶段。表面固生细菌包裹与其自身分泌的多聚糖基质中，形成了高度有组织的结构，这种结构具有不均质性，且在其中分布有可供运送养料、酶、代谢产物和排出废物的通道。
3 明胶酶在生物被膜形成中的作用
3.1 明胶酶（gelE）
明胶酶基因gelE是粪肠球菌分泌的一种Zn 金属蛋白酶，是流行病学资料和动物模型研究中的1 个致病因素。位于肠球菌染色体上，是一个28 ku 或32 ku的细胞外锌肽链内切酶（第二金属内肽酶；微生物蛋白酶），长度约1530 个碱基[7]，分子量约为31500，最适pH大概为6~8，等电点为4.6。其上游是粪肠球菌调节器fsr基因和3 个启动子，在转录水平调控明胶酶基因的表达；下游是丝氨酸蛋白酶基因sprE，由855 个碱基组成，与肠球菌损伤宿主组织有关[8]。明胶酶底物特异性的研究已经表明，它与疏水性和不溶性胶原相互作用。动物模型证实明胶酶及其调节基因fsr介导菌株的毒力作用，参与炎症进程，与肠球菌向感染灶周围扩散有关。R. Creti[9]等的实验结果表明，50%临床分离菌株表达gelE，健康人分离株仅27%阳性。在含30 g/L的明胶或15 g/L 的脱脂乳的半固体培养基上，蛋白酶产物很容易检测到。C M Waters[10]等利用fsr密度感应系统在高细胞密度条件下诱导表达gelE，gelE被证明是负责一些不稳定的Asc10（聚集物质）突变体的蛋白质，这意味着gelE的功能是清除细菌细胞表面错误折叠的蛋白质。一个标准的双球菌形态结构链是从5~10 个细胞，而破坏gelE生产会导致粪肠杆菌细胞链增长。在化脓性链球菌表达蛋白时，gelE的这一功能也显示出来。粪肠杆菌gelE表达时菌株更易自溶，这表明gelE影响细胞链的长度是通过激活自溶素。gelE也是聚合纤维蛋白降解的必要物质。gelE 表达降低cCF10 滴度，肽信息素诱导pCF10 共轭，且增加了pCF10 共轭到非gelE表达株中。gelE的这些功能表明它的作用是在高密度的环境中增加粪肠球菌的传播。
3.2 gelE缩短粪肠球菌链
根据C M Waters 等[10]试验，使用流式细胞计数法测定菌株的向散射光。每个菌株向散射光平均值的大小证实了gelE表达株和gelE突变株之间的差异是显著的，并且可在大范围内观察到。gelE 表达载体pMSP3614 电穿孔进入化脓性链球菌90-226，来测定gelE对粪肠球菌链长度的缩短能力是否是特效的。诱导gelE在90-226 表达导致链长度减少，但对双球菌单细胞并不是完全的。这表明，粪肠球菌gelE介导的链长度缩短的机制可能保存在化脓性链球菌90-226 菌株中。
3.3 gelE增加粪肠球菌自溶
粪肠球菌有两个独特的自溶素，一个是针对其自身细胞壁（胞壁质酶-1）有活性，另一个是针对溶壁微球菌细胞壁（胞壁质酶-2）有活性。在对溶菌酶-1 自溶素的初始特性描述中发现，肠球菌（粪肠球菌）液化亚种31 号菌株的锌金属蛋白酶(gelE)是通过激活溶菌酶-1 活性来加速粪肠球菌细胞壁裂解的。并且，蛋白酶抑制因子抑制胞壁质酶-1 由130-kDa 休眠形式转换到87-kDa 活化形式。
3.4 gelE降解聚合纤维蛋白
gelE降解纤维蛋白对粪肠球菌致病机制具有重要意义。粪肠球菌聚合纤维蛋白是OG1RF（粪肠球菌标准株）产生的一种分泌因子，可以降解纤维蛋白。检测过滤后的蛋白酶突变株固体培养基上清液，从而检验其降解纤维蛋白的能力，进而确定gelE和sprE是否是负责此表型。细菌分泌的蛋白酶破坏宿主组织，使细菌迁移和扩散。粪肠球菌感染血液，肠球菌心内膜炎增殖体形成过程中可能涂有聚合纤维蛋白。可以激活fsr系统中的增殖体，导致gelE诱导表达。纤维蛋白层周围的菌降解将使有机体进一步扩散。
3.5 gelE生物合成-激活外信息素
粪肠球菌2 个毒力相关蛋白酶明胶酶(gelE)和丝氨酸蛋白酶(sprE)的表达，是由fsr基因簇编码的密度感应系统正调控的。在此系统中，粪肠球菌分泌一种自诱导信号肽，明胶酶生物合成激活信息素(GBAP)触发fsrC-fsrA 双组分调控系统控制2 个转录物fsrBDC和gelE-sprE的表达。C. M. Waters 等[10]将筛选出来的放线菌代谢物作为fsr群体感应的抑制剂。粪肠球菌与每个放线菌培养物上清液培养测试，并分别用第1次筛选和第2 次筛选对明胶酶的生产和明胶酶生物合成激活信息素的生产进行了检查。Y33-1 株链霉菌的培养物上清液对明胶酶生产和明胶酶生物合成激活信息素生产有明显的抑制作用，而对粪肠杆菌细胞生长没有抑制作用。培养物上清液中的抑制成分是一种多肽抗素siamycin I[11]。Siamycin I 在亚微摩尔浓度抑制明胶酶和明胶酶生物合成激活信息素的生产，并在微摩尔浓度以上抑制粪肠球菌细胞生长。定量分析fsrBDC 和gelE-sprE转录物显示，siamycin I 在亚致死浓度下抑制两个转录物的表达。即使向培养物外加过量的明胶酶生物合成激活信息素，siamycin I 还是抑制明胶酶生产。这些结果表明，siamycin I 以非竞争性方式，通过fsrC-fsrA 双组分调节系统抑制GBAP的信号肽。亚致死浓度的siamycin I 也抑制生物膜的形成。
4 明胶酶调节器fsr和丝氨酸蛋白酶（sprE）
4.1 fsr调节器
粪肠球菌产生金属蛋白酶，可以降解宿主细胞基质相关分子。大约有60%的粪肠球菌临床分离株产生金属蛋白明胶酶。明胶酶的表达是通过控制总体的毒力调节位点fsr[12]。明胶酶基因上游和丝氨酸蛋白酶基因下游发现3 个agr 相似基因fsrA，fsrB 和fsrC，X. Qin等[13]试验表明agr 相似基因可能是自我调控，而且他们调节gelE和sprE表达，且gelE和fsr均是产生明胶酶所必需的。测试的fsrA，fsrB，sprE 突变株小鼠腹膜炎模型显示，与OG1RF标准株相比，sprE和agr 相似基因突变株非常显著的延长了小鼠的存活时间，与此前报道有相似的发现。在这个模型中，sprE和agr相似基因有助于增强粪肠杆菌OG1RF株的毒力。几个使用动物或线虫模型的体内研究已经表明，fsr系统有助于提高毒力[14]。
fsr 位点包含4 个基因，分别为fsrA、fsrB、fsrC 和fsrD。在该系统中，明胶酶生物合成激活信息素(GBAP)形成一个环状肽，作为自诱导肽。GBAP的前多肽原是由fsrD翻译，然后经FsrB诱导处理，从而使GBAP达到成熟形式。当GBAP 细胞外浓度积累达到阈值水平时，约为1 nm，它则触发由组氨酸激酶(fsrC)和反应调节因子(fsrA)组成的双组分调控系统。活化的fsrA诱导fsrBDC转录表达，它包含一个自动调节的循环，产生一种GBAP信号肽辅助剂，并最终诱导gelEsprE转录。
4.2 丝氨酸蛋白酶(sprE)
吴等[15]利用BLAST 将肺炎链球菌htrA蛋白酶编码基因与粪肠球菌染色体基因组进行同源性比较，发现粪肠球菌有一个全长为851 bp 的开放性阅读框与肺炎链球菌htrA 基因有较高的同源性，被命名为sprE。进一步研究表明，sprE 基因在细菌抵抗外界温度环境中具有一定的作用，sprE 基因在细菌抵抗外界氧化环境中也有重要作用。sprE 基因可能是粪肠球菌抵抗宿主内环境以及致病较为重要的因子，能够通过对它的突变降低粪肠球菌的毒力，获得减毒的粪肠球菌菌株[16]。
5 结语
肠球菌医院感染病例逐渐上升，耐药菌株日益增多，因此研究细菌生物被膜形成的相关遗传基因调控，维持机制以及和细菌耐药性之间的关系有十分重要的意义。通过不断深入研究，一定能找到治疗细菌生物被膜菌有关的感染疾病的有效途径，为新型减毒活疫苗的研究提供线索，为发现新途径攻克细菌耐药难题奠定理论基础。
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