崔佳琦1,2，魏丽娜1,2,3，蔡柏岩1,2,3
（1黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨150080；2黑龙江省普通高等学校微生物重点实验室，哈尔滨150080；3黑龙江东方学院，哈尔滨150086）
摘要：为探索接种F. mosseae 对连作大豆籽粒异黄酮及脂肪酸含量的影响，把F. mosseae 应用于连作大豆的生产提供理论依据。试验选用‘垦丰16’（中间型品种，KF16）、‘黑农44’（高脂肪型品种，HN44）和‘黑农48’（高蛋白型品种，HN48）作为试验材料。试验采用盆栽，每盆装风干土12.5 kg，土壤为连作0 年(CK)、1 年(L1)、2 年(L2)的大豆大田土壤。每盆接种F. mosseae 菌剂200 g。采用紫外分光光度计法和气相色谱法，对成熟大豆籽粒中异黄酮以及脂肪酸含量进行测定。结果表明：KF16、HN44和HN48分别在L1、L2、L2 时，异黄酮含量最高。KF16、HN44和HN48脂肪酸含量随连作年限增加而降低。接种F.mosseae 可以提高大豆异黄酮含量，降低脂肪酸含量。
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关键词 ：大豆籽粒；F. mosseae；连作；大豆异黄酮；大豆脂肪酸；含量
中图分类号：S181 文献标志码：A 论文编号：2014-0948
基金项目：黑龙江省教育厅面上资助项目“连作大豆土壤AM真菌菌群结构分析及其与根腐病病原菌相互关系研究”(12521394)。
第一作者简介：崔佳琦，男，1989年出生，黑龙江绥化人，在读硕士，研究方向为微生物生态学。通信地址：150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号黑龙江大学生命科学学院，E-mail：977670585@qq.com。
通讯作者：蔡柏岩，男，1968 年出生，黑龙江哈尔滨人，教授，博士，研究方向为微生物生态学。通信地址：150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号黑龙江大学生命科学学院，Tel：0451-86626691，E-mail：caibaiyan@126.com。
收稿日期：2014-09-22，修回日期：2014-11-27。
0 引言
大豆异黄酮以及脂肪酸是大豆生育进程中形成的次级代谢产物，是评价大豆品质及其质量的重要指标[1-3]。由于大豆长期连作造成病虫害加剧[4-5]、土壤理化性质不良[6]、根系有害代谢产物富集[7]等，致使大豆品质降低、产量下降。因此，大豆长期连作是限制大豆品质及产量的主要障碍。丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌是一种内生菌根真菌，它可以侵染植物根系，进而形成共生体[9-11]。通过菌丝体促进土壤形成团聚体[12-13]，固定土壤中的无机营养元素及水分[14-15]，改善土壤的理化性质[16]。AM真菌通过自身繁殖及分泌活化土壤酶[17-18]，可以增加土壤有机质含量，并且间接平衡根际土壤中包括N、P、K、Ca 等的无机元素及pH[19-21]，进而调节大豆根际土壤环境，促进大豆植株生长。
近年来，AM真菌对提高植物抗逆性研究日益增多，Manjula 等[22]研究表明AM真菌有利于植株吸收水分及营养物质，增强耐受性，有利于植物生长；Yamato等[23]指出AM真菌寄生于植株中，增强植株抗盐能力；杨海霞等[24]研究表明AM真菌可以增强植物抗氧化系统的反应，增强耐盐能力，提高高羊茅的生长；李淑敏等[25]研究指出AM真菌能够刺激大豆根瘤的形成，增强固氮能力，提高大豆品质；吴强盛等[26]研究指出AM真菌对白三叶的糖含量有影响。目前，AM真菌对连作大豆品质影响的研究较少。因此，笔者以连作大豆为切入点，通过接种F. mosseae，研究其对黑龙江地区种植面积广、代表性高的3 个大豆品种异黄酮以及脂肪酸含量的影响，旨在探明二者之间的关系，为把AM菌剂应用于连作大豆生产寻找理论依据，为改善连作大豆的品质进行有益的尝试和探索。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
试验于2013年5—10 月在哈尔滨工业大学糖业研究所试验站和黑龙江大学黑龙江省普通高等学校微生物重点实验室进行。
1.2 试验材料
供试材料选用3 个大豆品种：‘垦丰16’（中间型品种，KF16）、‘黑农44’（高脂肪型品种，HN44）、‘黑农48’（高蛋白型品种，HN48）。3 个大豆品种基本成分百分含量，见表1。
1.3 试验方法
1.3.1 试验设计土壤基本肥力指标见表2。试验采用盆栽，每盆装风干土12.5 kg，土壤为0、1、2 年的大豆大田土壤（0、1、2 年的土壤分别记为CK、L1、L2）。每盆接种F. mosseae 菌剂200 g。接种后，每盆土壤混匀。每个处理重复3 次。2013年5 月17日播种，每盆留苗3株。在盆体周围摆放种植大豆的盆体，作为保护行，降低边缘效应。各个生育时期正常浇水、除草、杀虫。大豆籽粒收获于2013 年10 月8 日，籽粒常温避光保存，以备后续检测试验使用。
1.3.2 大豆异黄酮含量测定采用紫外分光光度计法对大豆异黄酮含量进行测定[27]。
1.3.3 大豆脂肪酸含量测定采用气相色谱法对大豆脂肪酸进行测定[28]。测定时配置氢离子火焰检测器(FID)，可以准确地检测出大豆籽粒中含有较大碳正离子数的有机化合物。首先，对3 个基因型大豆籽粒进行处理，在旋风磨中研磨成粉，并过0.25 mm孔径筛。其次，对大豆籽粒粉末进行快速索氏抽提并对抽提产物进行甲酯化处理。最后，将所得试样进行气相色谱检测。
大豆籽粒中脂肪酸由多种不饱和化合物构成，其在进行气相色谱检测时，不同化合物表现出不同的保留时间以及峰面积。为了确定试样中各个化合物性质，试样各组分的保留时间与脂肪酸标准物中各组分保留时间进行比较，从而确定试样大豆脂肪酸的组分。
1.4 数据分析
采用SPSS 16.0 数据处理软件，气相色谱数据通过HWcomp软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 接种F. mosseae 对连作大豆异黄酮含量的影响2.1.1 不同品种不同连作年限总异黄酮含量的分析每个样品进行3 次重复试验。3 个大豆品种异黄酮含量的方差分析见表3。
2.1.2 同一品种不同连作年限总异黄酮含量的分析图1 表示接种F. mosseae 对同一大豆品种，不同连作年限大豆总异黄酮含量的影响。在不同连作年限土壤条件下，3 个品种大豆总异黄酮含量差异显著。
由图1 可得，接种F. mosseae 于不同连作年限土壤中，对KF16、HN44、HN48 大豆总异黄酮含量均有影响。KF16在L1总异黄酮含量最高，为2942.98 mg/kg，CK总异黄酮含量为2741.06 mg/kg，L2 总异黄酮含量在L1 与CK 之间；HN44 在L2 总异黄酮含量最高，为3475.24 mg/kg，L1总异黄酮含量为3277.49 mg/kg，CK时总异黄酮含量最低；HN48在L2总异黄酮含量最高，CK总异黄酮含量最低。KF16 随着连作年限的增长，总异黄酮含量先升高后下降；HN44和HN48随着连作年限的增长，总异黄酮含量逐渐升高，且KF16、HN44、HN48 3 个大豆品种分别在L1、L2 以及L2 总异黄酮含量最高，含量均高于CK。从此可见，接种F. mosseae 可以影响大豆异黄酮代谢途径中关键酶的合成，进而对大豆总异黄酮含量产生影响。同时也说明接种F. mosseae 可以促进植物分泌保护性物质，从而增强抗病性。
2.1.3 同一连作年限不同品种总异黄酮含量的分析图2 表示接种F. mosseae 对同一连作年限不同大豆品种总异黄酮含量的影响。同一连作年限下3 个大豆品种总异黄酮含量差异显著。
由图2 可得，在CK 条件下，3 个基因型大豆品种总异黄酮含量：HN44>KF16>HN48；在L1 条件下，3 个基因型大豆品种总异黄酮含量：HN44>KF16>HN48；在L2 条件下，3 个基因型大豆品种总异黄酮含量：HN44>KF16>HN48。由此可见，同一年限土壤接种F. mosseae，HN44 大豆籽粒总异黄酮含量最高，KF16大豆籽粒总异黄酮含量高于HN48。由此表明，由于3个大豆品种自身的遗传特性不同，致使其对F. mosseae的敏感度不同。同时也说明F. mosseae 对侵染的宿主具有一定的选择性。
2.2 接种F. mosseae 对连作大豆脂肪酸种类以及含量影响
气相色谱数据通过HWcomp软件进行分析，分析所得大豆脂肪酸种类以及含量见表4。由于每个试验样品设置3 个重复，数据量较大。通过对数据进行处理，得到其每组数据变异系数(RSD)均小于5%。故只列出每组试样数据的平均值。由表4 可知，3 个基因型大豆籽粒中所含脂肪酸种类基本相同，但各物质含量上相差较大。
2.2.1 同一品种不同连作年限大豆脂肪酸种类以及含量的分析图3 表示接种F. mosseae 对同一大豆品种不同连作年限大豆脂肪酸种类以及含量的影响。以脂肪型品种(HN44)大豆籽粒中脂肪酸种类以及含量为例（KF16和HN48均为此规律）。
由图3 可得，HN44大豆籽粒中亚油酸含量高于棕榈酸、硬脂酸、油酸以及α-亚麻酸，随着连作年限的增长，上述5 种物质的含量逐渐降低，但相对于对照组，变化量不大。说明F. mosseae 对不同基因型大豆脂肪酸代谢途径产生影响。
2.2.2 同一连作年限不同品种大豆脂肪酸种类以及含量的分析图4 表示接种F. mosseae 对同一连作年限不同品种大豆脂肪酸种类以含量的影响。以1 年土壤(L1)时大豆籽粒中脂肪酸种类以及含量为例。
由图4 可得，HN44中亚油酸和硬脂酸含量明显高于KF16 和HN48。HN44、HN48 中α-亚麻酸含量相差不大。油酸和α-亚麻酸含量均表现为：HN44>HN48>KF16。由此可见，不同基因型大豆自身遗传特性对大豆脂肪酸含量影响较大。同时也说明接种F. mosseae对大豆脂肪酸含量以及种类产生一定影响。
3 讨论
本项研究主要从生理方面揭示接种F. mosseae对连作大豆异黄酮和脂肪酸含量的影响，旨在阐明F. mosseae 与连作大豆2 个重要品质指标异黄酮和脂肪酸含量呈现出何种关系，为把F. mosseae 应用于连作大豆生产，减轻连作障碍，改善连作大豆品质提供理论依据，由此可见，本项研究对于AM菌剂是否能应用于连作大豆的生产进行了前期的有益探索，所以具有重要的理论和现实意义。
从本试验结果可以看出，不同连作年限土壤中接种F. mosseae，HN44、KF16、HN48 大豆总异黄酮含量在L1、L2 均高于CK；HN44、KF16、HN48 大豆脂肪酸在种类上CK、L1、L2 保持一致，但含量上CK 均高于L1、L2。说明接种F. mosseae 可以影响大豆品质，这与韩亚楠[29]、于文杰[30]试验结果相似。另外，从本试验结果还可看出，不同连作年限大豆接种F. mosseae，HN44、KF16、HN48 大豆总异黄酮以及脂肪酸含量差异显著。对于以上的研究结果究其原因可能为：一是3 个大豆品种具有不同的遗传特性，导致自身合成异黄酮以及脂肪酸能力的差异；二是F. mosseae 侵染宿主植物大豆后，可能对大豆代谢途径产生了影响，造成大豆总异黄酮含量以及脂肪酸含量差异；三是F. mosseae通过对宿主植物的影响，增加宿主植物在土壤中的吸收范围，显著提高植物对磷素和水分的吸收，增加植物的抗病性，促进苯丙氨酸裂解酶和异黄酮还原酶的合成，进而提高大豆异黄酮的含量；四是随着大豆连作年限的增长，大豆根际土壤中病原菌丰富度趋于稳定，F. mosseae 对致病菌生长抑制作用逐渐明显，从而降低植物感病率，使大豆脂肪酸种类以及含量发生变化。
笔者只是从大豆籽粒生理指标角度研究了接种F. mosseae 对连作大豆品质的影响，并未从大豆苯丙氨酸、脂肪酸代谢途径以及关键酶活性进行探索。因此，在后续的研究中可以从二者的代谢途径及关键酶活性、含量、合成等方面出发，揭示接种F. mosseae 对连作大豆异黄酮和脂肪酸含量的影响机理。
4 结论
不同连作年限土壤中接种F. mosseae，随着连作年限的增长，HN44、HN48大豆总异黄酮含量均表现出：L2>L1>CK，KF16 表现大豆籽粒中异黄酮含量表现为：L1>L2>CK。说明接种F. mosseae 可以促进大豆异黄酮的积累，有利于提高大豆品质。
不同连作年限土壤中接种F. mosseae，随着连作年限的增长，3 个大豆品种大豆脂肪酸种类保持不变，但随着连作年限的增长，各个物质的含量逐渐降低。说明接种F. mosseae 起到了缓解连作障碍的作用，但却降低了脂肪酸的含量。
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