赵邯郸，关淑艳，徐丹丹，刘 双，陈沼汀
（吉林农业大学生命科学学院，长春 １３０１１８）
摘要：以玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）自交系Ｈ９９、丹９８８、丹５９８的胚性愈伤组织为材料，利用农杆菌介导的方法将带有ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ＢＡＤＨ抗盐碱基因转入供试品种的胚性愈伤中， 通过愈伤组织对盐（ＮａＣｌ）的敏感性试验，确定愈伤组织适宜选择压，同时研究了２，４－Ｄ浓度对筛选结果的影响。结果表明，玉米自交系Ｈ９９在盐筛培养基中ＮａＣｌ浓度为２００ ｍｍｏｌ／Ｌ，２，４－Ｄ浓度为１.0 ｍｇ／Ｌ时筛选结果最佳。对移栽成活的４８棵抗盐转ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ＢＡＤＨ基因植株，经ＰＣＲ检测有３株呈阳性，阳性株率达到６．３％，初步证明目的基因已整合到玉米基因组中。
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关键词 ：玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）；愈伤组织；耐盐性；筛选；ＮａＣｌ
中图分类号：Ｓ５１３文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）01－0206-04
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．０54
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓａｌｔ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ Ｍａｉｚｅ Ｃａｌｌｕｓ
ＺＨＡＯ Ｈａｎ－ｄａｎ，ＧＵＡＮ Ｓｈｕ－ｙａｎ，ＸＵ Ｄａｎ－ｄａｎ，ＬＩＵ Ｓｈｕａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｚｈａｏ－ｔｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３０１１８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ＢＡＤＨ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ Ｈ９９， Ｄａｎ ９８８， Ｄａｎ ５９８ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃａｌｌｕｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｓａｌｔ （ＮａＣｌ） ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ２，４－Ｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ were studied． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｂｅｓｔ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅ Ｈ９９ ｉｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ＮａＣｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ２００ ｍｍｏｌ／Ｌ， ２，４－Ｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １.0 ｍｇ／Ｌ． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ ｓｕｒｖｉｖａｌ ４８ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＰＣＲ. Tｈｅｒｅ were ｔｈｒｅｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ plant with ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ of ６．３％. It is indicated that ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｏｍｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）；ｃａｌｌｕｓ； ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ＮａＣｌ
收稿日期：２０１４－０６－１６
基金项目：国家成果转化项目（２０１３ＧＢ２Ｂ１００１２５）；吉林省科技厅科技支撑项目（２０１２０２１５）；吉林农业大学启动基金项目（２０１２４２）
作者简介：赵邯郸（１９９０－），男，黑龙江绥化人，在读硕士研究生，研究方向为植物分子生物学与基因工程，（电话）１５８４４０１５２６６（电子信箱）
ｚｈｄ０３２７＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ；通信作者，关淑艳（１９７１－），女，教授，博士，主要从事生物化学与分子生物学研究，（电话）１３５０４４６７９６２
（电子信箱）４５８１９４０９５＠ｑｑ．ｃｏｍ。
盐碱地在世界上分布广泛，世界陆地总面积的７．６％为盐碱地［１，２］。中国是世界盐碱地大国之一，约有盐碱地０．２７亿ｈｍ２［３］。土壤盐碱化是限制农业生产的一个重要环境因素。随着灌溉面积的扩大，因灌溉水质下降及不合理的灌溉方式而引起的土壤次生盐渍化现象也日趋严重［４，５］。因此，对现有作物品种进行改良，培育耐盐作物新类型，已成为十分重要的研究对象。玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）是重要的粮食作物之一，也是最佳的饲料加工原料，还是重要的工业原料，在世界农业生产上有着举足轻重的地位。在中国人口增加及耕地面积逐渐减少的情况下，对玉米的需求也正在与日俱增。另外，中国是世界玉米生产大国，玉米对中国经济发展和市场稳定具有非常重要的作用。
随着转基因作物商品化的迅猛发展，转基因作物已经深入生活，同时也创造出巨大的效益。因此，培育出具有高产、耐盐、耐旱等优良性状的玉米一直是玉米育种工作者努力追求的奋斗目标［６］。在２０世纪９０年代，玉米转基因技术研究工作得到了飞速发展，农杆菌介导法、基因枪介导法、ＰＥＧ法、子房注射法等不仅在玉米上成功使用，而且技术完善成熟［７－９］。农杆菌是自然界中存在的天然基因工程载体，农杆菌介导法与其他转化方法相比，具有转化效率高、可转移较大的ＤＮＡ片段、转基因植株中外源基因拷贝数低、遗传较稳定及整合机理清楚等优点，所以利用农杆菌介导法改良粮食作物的产量及性状一直是研究的热点。
本试验以玉米自交系Ｈ９９、丹９８８、丹５９８的胚性愈伤组织为材料，利用农杆菌介导的方法将带有ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ＢＡＤＨ的抗盐碱基因转入玉米胚性愈伤中，通过愈伤组织对ＮａＣｌ的敏感性试验，确定了筛选抗盐基因玉米愈伤组织的有效选择压，研究了２，４－Ｄ浓度对筛选结果的影响，以期为后续遗传转化研究奠定基础，为玉米基因育种研究提供基础试验数据［１０］。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 外植体 采用玉米自交系Ｈ９９、丹９８８、丹５９８的胚性愈伤组织作为遗传转化的受体进行转化，3份材料由吉林农业大学植物生物技术中心实验室提供。
１．１．２ 菌种、质粒 农杆菌菌株ＥＨＡ１０５、质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ＢＡＤＨ，均由吉林农业大学植物生物技术中心实验室保存。
１．１．３ 培养基
１）基本培养基：Ｎ６培养基。
２）诱导培养基：Ｎ６培养基＋７００ ｍｇ／Ｌ Ｌ－脯氨酸＋５００ ｍｇ／Ｌ水解酪蛋白＋２ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ。
３）继代培养基：Ｎ６培养基＋１．０ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ。
４）筛选培养基：Ｎ６培养基＋不同浓度２，４－Ｄ＋不同浓度ＮａＣｌ。
以上培养基中均含４％蔗糖和０．８％琼脂，ｐＨ ５．８。
１．２ 试验方法
１．２．１ 培养材料的处理 取经人工套袋授粉１０～１５ ｄ的饱满且无病虫害的玉米雌幼穗扒去最外层数片苞叶，留３～５个苞叶，切取雌果穗头部无子粒部分，用７５％乙醇浸泡１０ ｍｉｎ，扒去所有苞叶及花丝后再用５０％的次氯酸钠溶液浸泡１５～２０ ｍｉｎ，然后将果穗置于超净工作台上，用无菌水冲洗３～４次，并削去中部子粒的上面１／３胚乳，用解剖针挑出大小约１．５～２．０ ｍｍ的幼胚。
１．２．２ 玉米幼胚愈伤组织的诱导和继代 取剥离玉米穗中部子粒的幼胚，将盾片向上接种于诱导培养基上。分别将Ｈ９９、丹９８８、丹５９８玉米自交系的玉米幼胚接种到２０个皿中，每个培养皿中接种３０个盾片，从诱导出的愈伤组织中挑选不透明、淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织夹碎到２～３ ｍｍ大小，每皿接种３０块，视各基因型产生的愈伤组织质量的差异，扩繁的数量也不同，以满足后续试验需求为宜。每１５ ｄ继代１次，共继代４次。
１．２．３ 农杆菌转化 将愈伤组织进行预培养，并用含有质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ＢＡＤＨ的农杆菌菌株划板于ＹＥＰ固态培养基（含１ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ）中培养，挑单菌落接种于５ ｍＬ ＹＥＰ液态培养基（含１ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ）中，２８ ℃振荡过夜培养，隔天放入５０ ｍＬ ＹＥＰ液态培养基中至其对数生长期ＯＤ值为０．５～０．６，离心收集菌体将其重悬于侵染液中备用，将预培养愈伤组织置于重悬后的菌液中，浸泡２５ ｍｉｎ，轻摇振荡，倒掉菌液，将外植体放入铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干愈伤组织表面多余的菌液，然后转入共培养培养基（含２００ μｇ／Ｌ Ａｓ），黑暗条件下培养３ ｄ。
１．２．４ 盐胁迫培养 将诱导培养基上获得的３个品种Ｈ９９、丹９８８、丹５９８的胚性愈伤组织接种到不同浓度的盐胁迫筛选培养基上，ＮａＣｌ浓度梯度依次为０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、２７５、３００ ｍｍｏｌ／Ｌ， ２，４－Ｄ浓度梯度依次为０、１．０、２.0、３.0 ｍｇ／Ｌ，每个梯度设置３次重复。以不添加NaCl和2，4-D的培养基为对照，２０ ｄ后及时统计愈伤组织存活率。根据愈伤组织存活率，确定愈伤组织最适宜的选择压。将筛选后的愈伤组织转至分化培养基，分化出的苗转至生根培养基［１１］。
愈伤组织存活率＝存活的愈伤组织块数／接种的愈伤组织块数×１００％。
１．３ ＰＣＲ检测
取抗性植株的叶片按照ＣＴＡＢ方法提取植物基因组ＤＮＡ，进行ＰＣＲ检测。反应体系为２５ μＬ。扩增反应参数：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ，９４ ℃变性５５ ｓ，退火５０ ℃ ５５ ｓ，７２ ℃延伸５５ ｓ，７２ ℃后延伸１０ ｍｉｎ，３５个循环。扩增产物于１．０％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外透射仪分析。
２ 结果与分析
２．１ 不同ＮａＣｌ浓度对玉米自交系筛选结果的影响
用玉米自交系Ｈ９９、丹９８８、丹５９８胚性愈伤组织进行耐盐性研究，观察统计各处理愈伤组织成活情况，用愈伤组织成活率分析玉米愈伤组织的耐盐性敏感浓度，结果见图１。由图１可知，随着培养基中ＮａＣｌ浓度的升高，各基因型的愈伤组织存活率明显下降，当ＮａＣｌ浓度达到３００ ｍｍｏｌ／Ｌ时，愈伤组织全部死亡；ＮａＣｌ的半致死浓度稍高于１７５ ｍｍｏｌ／Ｌ，对筛选结果有较明显影响；在ＮａＣｌ浓度为２００ ｍｍｏｌ／Ｌ时盐筛结果最佳，这３种不同基因型玉米自交系中，Ｈ９９的盐筛结果最佳。
２．２ 不同２，４－Ｄ浓度对玉米自交系筛选结果的影响
如图２所示，２，４－Ｄ浓度过高或过低都会影响不同基因型玉米自交系愈伤组织在筛选培养基中的存活率，其中２，４－Ｄ浓度为１.0 ｍｇ／Ｌ时盐筛结果最佳。２，４－Ｄ浓度不同对不同基因型玉米自交系的筛选结果也不相同。由不同浓度的２，４－Ｄ对３种基因型玉米自交系愈伤组织筛选的影响可知，其对Ｈ９９基因型的盐筛结果的影响最明显。
２．３ 抗性植株的ＰＣＲ检测
用ＣＴＡＢ法提取的玉米再生植株叶片ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，转化玉米获得转ＢＡＤＨ基因再生植株，利用ＢＡＤＨ引物按照ＰＣＲ体系进行扩增，扩增产物的电泳分析结果（图３）表明，转基因植株扩增出１ ５００ ｂｐ左右的特异条带，与阳性质粒作模板的ＰＣＲ扩增条带大小吻合，而非转基因的对照植株则无此特异条带，初步证明ＢＡＤＨ基因已整合到再生玉米植株中。经过筛选、分化、生根、移栽，有４８株转基因植株成活，通过在大棚种植，经过ＰＣＲ检测，其中阳性植株为３株，ＰＣＲ阳性植株率为６．３％。
３ 小结与讨论
植物组织和细胞在培养过程中可产生多种变异，若在加有高浓度盐分的培养基上培养愈伤组织和细胞，有可能筛选出耐盐细胞并再生出植株［１２，１３］。这种方法近１０多年来受到国内外学者的重视，并取得了一定的进展，现已筛选出烟草、水稻、首蓓、番茄、芦苇等植物的耐盐变异体并再生了植株［１４］。玉米是一种对盐分中度敏感的作物，选出具有分化能力高、耐盐性的愈伤组织是筛选出耐盐植株的关键。许多材料的愈伤组织或培养细胞经过长期的耐盐筛选后，往往丧失再生植株的能力，本试验过程中也遇到了同样的现象。ＮａＣl浓度过低，不易筛选出耐盐性较高的愈伤组织，同时也会造成过多的非转化植株存活，增加后续转化株的鉴定工作量［１５－１７］。相反ＮａＣl浓度过高，会扼杀已转化的细胞，筛选出的愈伤组织不能再生植株，且筛选频率很低。为了获得耐盐再生植株，本试验采用了尽量减少耐盐愈伤组织继代次数和降低培养基中ＮａＣl浓度等措施，取得了一定成效［１８］。
本研究通过统计玉米自交系Ｈ９９、丹９８８、丹５９８胚性愈伤组织在含有不同浓度ＮａＣｌ及不同浓度２，４－Ｄ的筛选培养基上的愈伤存活率的情况，结果表明，当ＮａＣｌ浓度为２００ ｍｍｏｌ／Ｌ，２，４－Ｄ浓度为１.0 ｍｇ／Ｌ时玉米愈伤组织存活率最高，其中Ｈ９９、丹９８８、丹５９８ ３种基因型中Ｈ９９的愈伤组织存活率最高。转化玉米获得转ＢＡＤＨ基因再生植株，阳性植株率达６．３％，对于其他相关因素还需进一步的分析。
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（责任编辑 赵 娟）